Isolering och odling av aviär Embryonala Klaffel progenitorceller

1. Förberedelser

1. Inkubera fertila vaktlar eller ägg kyckling till stadium 14 ^- (ca 2 dagar) eller 25 (ca 4,5 dagar) vid 60% luftfuktighet och 37 ° C.
2. Förbered sterila Earls Balanced Salt Solution (EBSS)
   1. Tillsätt 100 ml 10X EBSS till 600 ml 18 Mohm vatten
   2. Tillsätt 2,2 g natriumbikarbonat
   3. Justera lösningens pH till 7,2
   4. Koka upp lösningen upp till 1000 ml
   5. Sterilisera lösningen genom att passera genom en 0,2 ìm filter
3. Förbered sterila M199 odlingsmedium.
   1. Tillsätt 1 paket M199 pulver till 700 ml 18 Mohm vatten.
   2. Tillsätt 2,2 g natriumbikarbonat
   3. Justera lösningens pH till 7,2.
   4. Tillsätt 10 ml (1%) Penicillin-streptomycin
   5. Koka upp lösningen upp till 1000 ml
   6. Sterilisera lösningen genom att passera genom en 0,2 ìm filter
   7. Tillsätt 1 mL steril 100X Insulin-Transferrin-Selenium-G tillägg
   8. Tillsätt 10 ml (1%) steril kyckling serum
4. Förbered tredimensionella kollagen geler på en kollagen koncentration av 1,5 mg / ml. Tidigare arbete i vårt labb har visat att en kollagen koncentration av mer än 1,5 mg / ml ger en matris som är för biomekaniskt styv för cellerna att gå igenom. Kollagen gel koncentrationer lägre än 1,5 mg / ml har så få kollagenfibrer att cellen klump kan strimla fibrer lokalt, som producerar en ö av celler.
   1. Lägg till följande iskalla reagens till en steril 15 ml centrifugrör i ordning:
      • 3X M199: Volym = totala volymen som behövs / 3
      • Sterilt 18 Mohm vatten: Volym = totala volymen som behövs (M199 volym + kyckling serumvolymen + 0,1 M NaOH volym + kollagen volym)
      • Sterila kyckling serum: Volym = totala volymen som behövs * 0,01
      • Rat svans kollagen I: Volym = (kollagen gelhalten * total volym som behövs) / kollagen lager koncentration
      • Steril 0,1 M NaOH: Volym = kollagen volym * 0,2
        Anmärkning: mängd vatten, 0,1 M NaOH, och kollagen lagt kommer att variera beroende på koncentrationen av kollagen stamlösning.
   2. Blanda kollagen lösningen väl med en steril pipett.
   3. Överför omedelbart 0,3 mL av kollagen lösningen i 1,9 cm ² brunnar tillväxtomrÃ¥de. Detta är tillräckligt kollagen lösning för att helt täcka bra och ge en gel som är cirka 3 mm tjock. En gel tjocklek av minst 250 ìm är nödvändig för studier cell invasion.
   4. Låt kollagen lösningen gel i minst 1 timme vid 37 ° C, 5% CO _2, och 100% luftfuktighet.

2. Pre-EMT endokardiell Cell isolering och odling

1. Embryo isolering
   1. Placera en tum lång bit av laboratorium tejp över den större änden av ägget. Det är där luften cellen finns. Bandet stabiliserar den bräckliga vaktelägg skal.
   2. Försiktigt punktera tejpade området ägget i luften cellen med spetsen på steriliserade böjd sax.
   3. Skär ett hål i tejpade delen av ägg som är stor nog att låta äggulan att passera. Starta hålet vid punktering och skär utåt i en spiralform. Se till att skära igenom det yttre membranet, men undvik piercing äggula.
   4. När hålet i skalet är klar visualisera vaktel embryot. Embryot är normalt placerad på ovansidan av äggula.
   5. Börja med att hälla äggulan genom hålet i ägget med en hand. Håll en # 55 pincett i den andra handen. Som embryot lämnar ägg på ovansidan av äggulan försiktigt skjuter # 55 pincett under embryot och ta bort den från äggula. Obs: För hönsägg innebär embryot isolerad sprickbildning kyckling ägg på en vass, ren yta och bryta ägget i en 100 mm petriskål. Embryot ska placeras på ovansidan av äggula. Försiktigt # 55 pincett under embryot och ta bort den från äggula.
   6. Placera embryot till en 100 mm petriskål med iskall, steril EBSS.
2. Steg embryona enligt kriterierna i Hamburger och Hamilton ^1. Embryon i etapp 14 ^- är tidigare stadium 13, men ännu inte i etapp 15, med 20-21 somites och en svans knopp. En viktig egenskap hos etapp 14 ^- embryon är huvudet vinkel, vilket är något större än 90 ° mot kroppen.
3. Ta ut hjärtan från vaktel embryon i etapp 14 ^- med # 55 pincett genom att skära på tvären där AV-kanalen och OFT får kontakt med bröstkorgen. Placera hjärtan tillsammans på ena sidan av petriskål.
4. Samla isolerade hjärtan med en steril överföringspipett och placera dem i en ny 100 mm petriskål fylld med steril, iskall EBSS.
5. Skär OFTs och AV-kanaler på tvären från ventriklarna med # 55 pincett.
6. § återstående AV-kanaler och / eller skrifter utflöde (OFTs) i längdriktningen.
7. Ställ en pipett till en volym av 20 ul. Använd denna pipett att aspirera sex längden skuren AV-kanaler och OFTs.
8. Utvisa den AV-kanalerna och OFTs på kollagen gel. Aspirera överflödig EBSS från ytan av gelen.
9. Använd # 55 pincett för att orientera explants så de är platta och så lumen sidan är vänd mot kollagen gel. Försök att inte punktera kollagen gel med pincett.
10. Efter 2 timmar vid 37 ° C och 5% CO _2, ta bort hjärtmuskeln från explants med # 55 pincett. Den endokardiell celler bör lämnas kvar på ytan av kollagen gel. Alternativt kan hjärtmuskeln vara kvar på Explantation. Med hjärtmuskeln bort, endokardiell cellerna med inte genomgå EMT utan ingripande. Med hjärtmuskeln presentera en delmängd av endokardiell celler kommer att omvandlas till mesenkym, men graden av omvandling kan moduleras med yttre faktorer. OBS: Även om hjärtmuskulaturen kommer att vara kvar på, måste Explantation ges minst 2 timmar att fästa på gelen innan mediet läggs till.
11. Tillsätt 0,4 mL M199 i varje brunn som innehåller explants.
12. Kultur cellerna vid 37 ° C, 5% CO _2, och 100% luftfuktighet.

3. Post-EMT AV-Cushion mesenkymala cell isolering och odling

1. Spricka kyckling ägg på en vass, ren yta och bryta ägget i en 100 mm petriskål. Embryot ska placeras på ovansidan av äggula. Plocka upp embryot med # 5 pincett genom att ta tag i membranen som omger embryot och sedan placera embryot till en 100 mm petriskål fylld med iskallt, sterilt EBSS.
2. Steg embryona enligt kriterierna i Hamburger och Hamilton ^1. Dragen av en scen 25 embryo avses en avgränsad armbågs-och knäledsartros och lätt öga pigmentering.
3. Isolera hjärtan från alla HH25 embryon och placera hjärtan tillsammans på ena sidan av petriskål.
4. Samla isolerade hjärtan med en steril överföringspipett och placera dem i en ny 100 mm petriskål fylld med steril, iskall EBSS.
5. Isolera AV-regionen från alla hjärtan på en gång. Placera AVs tillsammans på ena sidan av petriskål. Skaka försiktigt AV-regionen att ta bort alla blodet, vilket kan påverka cellernas livskraft.
6. Samla isolerade AVs med en steril överföringspipett och placera dem i en ny 100 mm petriskål fylld med steril, iskall EBSS.
7. Sekventiellt isolera kuddar från AV. Se till att det inte finns någon myokardiet finns på AV-kuddar.
8. Samla isolerade kuddar med en steril överföringspipett och placera dem i en steril 15 ml centrifugrör.
9. Snurra kuddar till botten av centrifugröret vid 15 xgi 3 minuter.
10. Använd en steril 1000 ml tips att ta bort så mycket av EBSS supernatanten som möjligt utan att störa kuddar.
11. Tillsätt 1 mL 0,25% Trypsin-EDTA som har förvärmas till 37 ° C. Låt kuddar att ruva i trypsin tills de är helt upplöst, vilket är normalt cirka 3-5 minuter.
12. Tillsätt 100 mikroliter av kyckling serum till centrifugröret att släcka trypsin.
13. Pellets cellerna vid 160 xgi 5 minuter. Avlägsna supernatanten med en steril, 1000 mikroliter spets.
14. Resuspendera cellerna i 2 ml M199 medelstora och blanda genom att pipettera. Ta 10 mikroliter av cellsuspensionen räkna med hemocytometer och bestämma det totala antalet celler som har isolerats
15. Bestäm hur mÃ¥nga kollagen geler kommer att göras baserat pÃ¥ antalet av isolerade celler. Celler mÃ¥ste klädd vid en densitet av 2 x 10 ⁵ celler / ml med en 250 mikroliter gel volym.
16. Pellets cellerna vid 160 xgi 5 minuter. Avlägsna supernatanten med en steril, 1000 mikroliter spets.
17. Använder protokollet anges ovan, lägg 3X M199, vatten, kyckling serum, kollagen och 0,1 M NaOH, i den ordningen, till cellpelleten. Blanda genom försiktig pipettering.
18. Tillsätt 250 mikroliter i varje 1,9 cm ² tillväxtomrÃ¥de väl.
19. Låt kollagen lösningen gel i minst 1 timme vid 37 ° C, 5% CO _2, och 100% luftfuktighet.
20. Tillsätt 0,4 mL odlingsmedia och inkubera över natten.
21. För att fortsätta odla de geler i stressfria förhållanden befria geler från sidorna av kulturen och med en steril 200 mikroliter pipettspetsen. Mekaniskt begränsad kulturer är geler som sitter kvar på sidorna av kulturen också.

4. Representativa resultat

Figur 1:. Exempel på embryon (A) HH14-vaktlar embryo, och (B) HH25 kyckling embryo visas här.

fig2.jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2: HH14-ventil endokardiell explants efter 2 timmar av kultur (A) med hjärtmuskeln närvarande, eller (B) med hjärtmuskeln bort..

Figur 3:. HH14-ventil endokardiell explants (A) med hjärtmuskeln närvarande många av cellerna genomgår endokardiell till mesenkymala omvandling och har en spolformad, mesenkymala fenotyp efter 48 timmar av kultur. (B) När hjärtmuskeln tas bort alla celler upprätthålla en kullersten-formad, endokardiell fenotyp efter 48 timmar i kulturen.

Figur 4:. HH25 ventil mesenkymala celler i en kollagen gel Cellerna är rundade direkt efter sådd.

Figur 5:. HH25 mesenkymala celler i kultur (A) Efter 48 timmar av kultur i en begränsad kollagen gel HH25 mesenkymala celler börjar sprida sig. (B) HH25 celler i en stressfri kollagen gel 7 dagar efter sådd och 6 dagar efter befrielsen har pressats gelen till cirka 50% av den ursprungliga området.

Metoden för att isolera endokardiell celler från scenen HH14 ^- hjärtan som ursprungligen utvecklades av Runyan och Markwald ger en kontrollerad, in vitro-miljö för att studera vilka faktorer som initierar och modulera embryonala EMT ^2. HH14 ^- endokardiell explants odlade utan att hjärtmuskeln inte genomgå EMT utan biomekaniska eller biokemiska intervention. Om hjärtmuskeln är kvar på Explantation det kommer att signalera en delmängd av endokardiell celler genomgå mesenkymala förvandling, men externa faktorer kan reglera denna process. Isolera embryonala stamceller mesenkymala celler från HH25 AV-ventil kuddar med metoden beskrivs av Butcher et al. Erbjuder en möjlighet att bestämma vilka signaler köra differentiering mot mogna valvulär interstitiella celler ^3. Odling av celler i mekaniskt stressad eller stressfria förhållanden tillåter forskaren att söka biomekaniska stimuli, och faktorer som läggs till odlingsmediet kan ge biokemiska signaler. In vitro-modeller som hjälper till att tolka mekanismer som påverkar EMT, celldifferentiering och strukturella remodeling kan användas för att bättre förstå orsakerna till medfödda hjärtfel och kunde hjälpa till att avgöra sätt att köra stamceller mot mogna fenotyper ventil celler för tillämpningar tissue engineering.