Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

1, 1, 2

1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine (UCI), 2Department of Molecular Biology and Biochemistry, Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine (UCI)

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 50.16.166.175, User IP: 50.16.166.175, User IP Hex: 839952047

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e216, doi:10.3791/216 (2007).

Abstract: Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Sivrisinek genomların ekzojen genlerin giriş, özel ilgi türü için hazırlanmış mikroenjeksiyon teknikleri gerektirir. Bu video protokol dönüştürülmüş sivrisineklerin nesil için Anofel stephensi embriyolar DNA yapıları microinject James laboratuvar tarafından kullanılan bir yöntem gösteriyor. Teknikleri, mikroenjeksiyon iğneler hazırlanması, toplanması ve hazırlanması embriyolar ve mikroenjeksiyon işlemi için gösterilmiştir.

Protocol: Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Mikroenjeksiyon, önceden hazırlanması:

  1. Kan linki sivrisinek: Pazartesi - Çarşamba önceki Cuma günü linki kadın enjeksiyon için. Aynı hafta Pazartesi, Perşembe ve Cuma günleri, yem kadın enjekte etmek.

  2. Kuvars iğne programı 2 ve izotonik tampon (Malzeme) kullanarak hazırlayın.

  3. Embriyolar "tüp Döşeme" düzenli Drosophila kültür flakon. Kapsayan filtre kağıdı ıslak bir disk ile alt Islak pamuk.

  4. Bir ucunda çift taraflı bant yapıştırma, plastik kapak kayma hazırlayın. Trim kaset kapağı için, kapak kayma kenarında biter, böylece kayma.

  5. Kuruma petrol hazırlayın.

  6. Petri kabı, kuluçka için embriyo transferine izotonik tamponu ile hazırlayın.

Zorla döşeme ayarlayın:

  1. Toplayın ve bir aspiratör ile 6-10 kan beslenen kadınlarda, pamuk ve izotonik tampon ıslak filtre kağıdı ile Drosophila kültür flakon aktarabilirsiniz .

  2. Sivrisinek sonra karanlıkta insectery koşullar içine geri koyun ve 1 saat ve 15 dakika için yumurtalarını bırakmak için izin.

  3. Yetişkin kafes içine sinek ve embriyolar ile filtre kağıdı diski çıkarın.

  4. Yumurta kadar satır için, diseksiyon kapsamında bunu. (Sable, No 0000) ince bir fırça ile yumurta demet toplayın ve hazırlanmış bir kare izotonik tampon ile ıslatılmış 3MM whatman kağıt transfer. Tüm zamanların ıslak kağıt tutun. Yumurta kurutulmuş almak izin vermeyin. Exochorion fırça ile kaldırın, daha iyi bant yumurta sopa yardımcı olur.

  5. Ince forsepsle No 5 ya da ince bir fırça kullanarak, koyu gri embriyolar pick up ve izotonik tampon ile ıslak 3MM whatman kare doğrultusunda düzenlemek. 20-30 embriyolardan Hattı. Enjeksiyon arka kutupta yer gibi tüm embriyolar aynı yönde olmalıdır. Embriyoların ön arka biraz daha geniş. Sonra 3MM whatman kağıt şeritleri kullanarak, yumurta, yumurta hattının her iki tarafında sert basarak, yumurta dokunmadan dizilmiş filtre kurulayın.

  6. Yumurta transfer etmek için, çift taraflı bant (Tıp) içeren slayt, invert ve yumurta karşı hafifçe basın. Yumurta arka ucunda çift taraflı bant kenarına çok yakın olması. Yapışmaz çok ıslak ise kağıt ıslaklık, bunun için kritik öneme sahiptir. 5-10 saniyelik embriyoların kuruma, ancak kuruma süresi mikroenjeksiyon oda nemli ve sıcaklık bağlıdır.

  7. Biraz çok ve embriyolar yumurtadan olmaz: Kuruma yumurta için çok önemlidir. Kuruma DNA olmadan embriyo girecek değildir.

  8. Kurutulmuş embriyolar daha fazla kuruma önlemek için Halokarbon yağ ile kaplayın.

Embriyoların Mikroenjeksiyon:

En önemli özelliği iyi bir enjeksiyon (Not bakınız) iğne kalitesidir.

  1. Microloader (Eppendorf # 5242 956,003) kullanarak enjekte edilecek DNA çözümü ile bir iğne doldurun. Çok az enjeksiyon soliution, 1 - 2 ml gereklidir.

  2. Iğne, enjeksiyon süresi ve basınç kontrolleri Eppendorf Transjector, yanı sıra backpressure bağlayın. Mikroenjeksiyon x 10 büyütme ve mikromanipülatör (Leica) hareketli bir sahne (Leica) bir mikroskop kullanılarak yapılır. Gerekirse, yükseltilmiş bir mikroskop aşamada 4-5 mikroskop lamı istifleme tarafından hazırlanmış olabilir. Yükseltilmiş sahneye taşıyan embriyolar kapak kayma yerleştirin. Embriyolar 150 ° açıyla enjekte edilir; penetrasyon arka kutupta olmalıdır. Enjeksiyon için iğne sabit tutmak ve mikroskop aşamasına taşımak. Iğne ucu kapalı ve genellikle ilk enjeksiyondan tatili. Ben her zaman, her enjeksiyon arasında DNA'nın küçük bir damla petrol sınırdışı için gerekli olan basınç çalışır.

  3. Ben 0.2 enjeksiyon süresi 0.9 saniye ve 1000 hPa iğne yeni. Kadar küçük bir damlacık yağın içine iğne çıkan basınç ve zaman değişir. Backpressure yaklaşık 100 ayarlanması gerekir. Iğne ucu aşınmış alır gibi, enjeksiyon basıncı, enjeksiyon hacmi düşük tutmak için (yaklaşık 300 hPa) azaltılmalıdır. Bundan sonra, iğne ucu çok büyük ve embriyoların çoğu öldürüyor.

  4. Enjeksiyondan sonra, kağıt mendil ile petrol çıkarmak ve embriyo ve izotonik tampon Petri kabında yer slayt kapağı. Insectory yemekleri yerleştirin ve embriyoların yumurtadan kadar orada bırakın. Bunlar 2-6 gün sonra yumurtadan çıkar başlar. Tutam toprak balık yemi ile distile su larva transferi.

Notlar

Enjeksiyon için DNA: enjeksiyon için Plazmid DNA çözüm EndoFree plazmid kiti kullanılarak izole edilmiştir.Plazmid Construct ve doğru konsantrasyon birlikte Yardımcısı plazmid karışımı, isopropanol hızlandırdı. Pelet enjeksiyon tampon resuspending önce% 70 etanol ile yıkandı. Enjeksiyon, önce Millex-GV sütun kullanarak temiz DNA.

Izotonic tampon:

1.68 M NaCl - 88.3 ml

1.68 M NaCl - 2.9 m

1 M -10.7 ml HEPES

1.12 M CaCl 2 - 2,2 ml

dH 2 O - 896 ml 		VEYA 5 M NaCl - 29,67 ml

1 M KCI - 4.87 ml

1 M HEPES - 10.7 ml

1.12 M CaCl 2 - 2,2 ml

dH 2 O - 952,56 ml

PH 7.2 'ye ayarlayın

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Materials: Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Name Type Company Catalog Number Comments
Injection Quartz needles Sutter Instrument Co. O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller Tool Sutter Instrument Co. P-2000 Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit Qiagen
Isopropanol
Millex-GV column SLGV RO4 NL for DNA cleaning
Construct DNA 0.5 mg/ml
Helper plasmid 0.3 mg/ml
Injection solution Buffer 1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer see recipe in the protocol section
Dessication oil Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood to feed mosquitos
Anopheles stephensi Animal Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial for egg laying
Petri dishes with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader Eppendorf 5242 956.003
Transjector Eppendorf
Microscope Leica Microsystems with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification

Ask the Author: Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

2 Comments

What percentage hatch? What percentage make it to adults? What is the transformation rate?

 

Thanks,

 

Randy Saunders

Virginia Tech

1

Reply

Posted by: Randy SaundersAugust 4, 2008, 3:36 PM

The efficiency in each step is varying depending on the experience of the person injecting, but also other mostly unknown factors. We can get 5-40% of the embryos hatching, but normally 10-20%. Of the larvae that hatch most (80-90%) make it to adults. If we inject about a 1000 embryos over a two week period, we usually screen 5000-10.000 larvae from some 50 families and obtain commonly 2-6 transgenic lines. The number of lines can be greater or smaller depending on experience and also plasmid size. Usually an Anopheles stephensi injection yields some lines with just a few or a single transgenic larva and some lines with tens or hundreds of transgenic larvae.

1.1

Reply

Posted by: Olle TereniusAugust 6, 2008, 5:27 PM

Do you have the manufacturer or model number of the pipette tip you use to backload your microinjection needles? The information would be quite helpful. Thanks! Tom Chi, UCSF

2

Reply

Posted by: Thomas C.July 7, 2009, 4:42 PM

That would be the Microloader Eppendorf 5242 956.003 mentioned in the Materials section above.

2.1

Reply

Posted by: Olle T.September 14, 2009, 8:41 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter