Синий Родные электрофореза в полиакриламидном геле (BN-PAGE) для анализа Multiprotein Комплексы из ячеистого Лизаты

Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

Multiprotein комплексов (ПДК) играют важную роль в клеточной сигнализации, так как большинство белков может быть найден в функциональном или нормативных комплексов с другими белками (Сали, Glaeser и соавт. 2003). Таким образом, исследования белок-белковых взаимодействий сетей требует детальной характеристики ПДК, чтобы получить понимание интегративной функции белка и регулирования. Для идентификации и анализа, ПДК должны быть разделены по родной условиях. В этом видео мы описываем анализ ПДК синим родной электрофореза в полиакриламидном геле (БН-PAGE). БН-страница представляет собой метод, который позволяет разделение ПДК в нативной конформации с высоким разрешением, чем предлагаемые гель-фильтрации или центрифугирования плотности сахарозы, и поэтому полезен для определения ПДК размер, состав и относительное изобилие (Schägger и фон Jagow 1991) ; (Schägger, Крамер и др., 1994.). С помощью этого метода, белки разделяются в зависимости от их гидродинамические размеры и форму в полиакриламидном матрицы. Здесь мы демонстрируем анализ ПДК от общего числа сотовых лизатов, указывая, что лизат диализ решающий шаг, чтобы сделать БН-СТРАНИЦА, применимых к этим биологическим образцам. Используя комбинацию первого измерения БН-и второе измерение SDS-PAGE, мы покажем, что ПДК, разделенных БН-страница может быть далее подразделены на их отдельных компонентов на SDS-PAGE. Визуализация компонентов ПДК на гель разделение осуществляется стандартным иммуноблоттинга. В качестве примера для MPC анализа БН-страницу, мы выбрали хорошо известных эукариотических 19S, 20S, 26S и протеасом.

** Это видео протокол основан на связанный публикации ^1: Голубые Родные электрофореза в полиакриламидном геле (BN-PAGE) для идентификации и анализа Multiprotein комплексов. Махима Свами, Габриэль М. Siegers, Susana Minguet, Бернд Wollscheid и Вольфганг WA Schamel. STKE Науки 2006 (345): pl2 25 июля 2006 года [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть эту публикацию .

1. Подготовка диализу лизат ячейки

1. Урожай 10х10 ⁶ клеток и гранул центрифугированием при 350g в течение 5 мин при 4 ° C.
2. Промыть осадок клеток в три раза с 1 мл ледяной PBS (рецепт 1), центрифуги, как в пункте 1.1.
3. Ресуспендируют осадок в 250 мкл ледяной БН-лизирующего буфера (рецепт 2) и инкубировать на льду в течение 15 мин.
4. Центрифуга при 13000 г в течение 15 мин при 4 ° С для удаления нерастворимого материала.
5. Растопить отверстие в крышке 1,5-мл микроцентрифужных трубки использованием подогревом большой стороны диаметр пипетки Пастера, затем поместите трубку на лед для охлаждения до 4 ° C.
6. Передача супернатант с шага в 1,4 охлажденной трубки с отверстием в крышке.
7. Место диализных мембран (молекулярная масса отсечки 10 кДа) щипцами сверху открыл трубу, закройте крышку, и отсек избыток мембран диализа, что торчит.
8. Уплотнение крышки на стороне тщательно парафильмом.
9. Обратить труб и центрифуги вверх дном на минимальной скорости возможно в 50-мл конические пробирки в центрифугу культуре клеток в течение 10 сек при 4 ° C. Удалить перевернутая трубка из центрифуги с помощью пинцета, чтобы избежать превращения стороне трубки право.
10. Подготовка 100-мл стакан с холодной диализа БН-буфера (рецепт 3) и мешалки. Используйте как минимум 10 мл БН-диализа Буфер на 100-мкл образца.
11. Прикрепите трубку с лентой вверх-вниз внутри стакана, и удалить пузырьки воздуха из отверстия под крышкой использованием изогнутых пипетки Пастера.
12. Место стакан поверх магнит мешалки, включите мешалку и оставить на 6 часов или на ночь в холодной комнате. Проверьте иногда, чтобы обеспечить перемешивание не создавая воздушных пузырей на диализе мембраны.
13. Сбор диализу лизат ячейки в новой охлажденной трубки микроцентрифужных.

2. Заливка БН-гели

1. Градиент заливки геля происходит при комнатной температуре с градиентом смесителя. Перчатки необходимо надевать, потому полиакриламидном очень нейротоксическое. Избегайте контактов с SDS.
2. Место градиент миксером на мешалки и приложите его к кусок гибкого шланга. Закрыть канал с помощью клапана и закройте трубки с зажимом. Место магнитной мешалкой 15% в "высокий" цилиндр связан с трубкой.
3. Тема гибкий шланг в peristalitic насоса и присоединить иглу шприца до конца. Затем поместите иглу между двумя стеклянными пластинами гель аппарата.
4. Подготовка 4% (рецепт 5) и 15% (рецепт 6) разделения гель решения, добавив, APS и TEMED непосредственно перед употреблением. Комбинированный объемов должен быть равен объему разделения гель.
5. Залить этим гелем решения в соответствующие цилиндры градиент микшера (4% в "низкий" и 15% в "высокий" цилиндр).
6. Откройте клапан и вытеснить пузырьки воздуха внутри канала, соединяющего два водохранилища гель, нажав на левую цилиндр с большим пальцем.
7. Включите магнитной мешалкой, снимите зажим, и включить насос peristalitic по 5 мл в минуту. Разрешить гель медленно потока между стеклянными пластинами. Убедитесь, что игла всегда выше жидкости.
8. Разрешить все жидкости ввести гель аппарата, а затем наложение осторожно изопропанола. Разрешить гель для полимеризации, по крайней мере 30 мин при комнатной температуре.
9. Чистая проливным аппарата сразу с дН ₂ O (не используйте моющие средства).
10. Удалить изопропанол, промыть дН ₂ O, и удалить дН ₂ O с ватмане.
11. Подготовка 3,2% концентрирующий гель (рецепт 7), добавив, APS и TEMED непосредственно перед употреблением.
12. Налейте концентрирующий гель на вершине разделения гель и ввести гребень между стеклянными пластинами, избегая пузырей. После укладки гель полимеризуется, прохладный гель до 4 ° C.
13. Непосредственно перед загрузкой образца, удалите гребень медленно, потянув ее под углом к ​​плоскости геля. Это позволяет воздуху поступать в карманы быстро, что улучшает качество скважин.

3. Разделение диализу лизат ячейки БН-СТРАНИЦА

1. Нагрузка от 1 до 40 мкл лизата диализу и от 10 до 20 мкл Маркер Mix (рецепт 10) в сухих скважин при температуре 4 ° C. Наложение образцов в каждую лунку с холодным катодом буфера (рецепт 8).
2. Заполните внутренней камеры с холодной Cathode буфера и наружный / нижняя палата с холодной буфера Анодные (рецепт 9).
3. Применить от 100 В до 150 В или minigel в значительной гель, пока образцы ввели разделение геля. Выполнить гель при температуре 4 ° C.
4. Повышение напряжения до 180 В (minigel) или 400 В (большие гель) и продлится до красителя перед достигает конца геля. Запустить занимает от 3 до 4 часов для мини-и от 18 до 24 часов для большого геля.

4. Второе измерение SDS-PAGE

1. Подготовка стандартных 10% SDS-гель (рецепты 12-15) с одной большой полосы для первого измерения БН-PAGE переулок, одну очередную полосу движения для маркер молекулярного веса, и одну очередную полосу движения для Аликвоту диализовали лизат, которая смешивают с SDS образца буфера (рецепт 11) и кипятят в течение 5 мин при 95 ° C. Используйте прокладки, толщина которых была увеличена на два слоя скотча для упрощения загрузки БН-ПААГ геля на SDS гель.
2. Удалить БН-PAGE гель в плиты из аппарата электрофореза и аккуратно приподнимите одну пластину.
3. Удалить концентрирующий гель и вырезать полосу БН-PAGE гель, содержащий белки, представляющих интерес.
4. Место БН-ПААГ геля в 2 раза SDS буфера выборки и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
5. Отварите БН-PAGE геля кратко (не более 20 сек) в микроволновой печи.
6. Инкубируйте БН-PAGE геля в горячей Пример SDS буфера в течение еще 15 минут при комнатной температуре.
7. Нагрузка БН-ПААГ геля в больших свыше укладки гель SDS-PAGE гель избегая пузырьков воздуха, и наложения ломтик буфером Пример SDS. Нагрузка маркер и лизат контроля.
8. Выполните электрофореза в соответствии со стандартными протоколами.

5. Обнаружение подразделения ПДК иммуноблоттинга

1. Для передачи, подготовить шесть Ватман бумаг и мембраны PVDF установки на размер SDS-гель.
2. Инкубируйте мембраны PVDF в 100% метаноле в течение 30 с и понежиться Ватман статей в буфер передачи (рецепт 16).
3. Поместите три ватмана бумаг, мембраны PVDF, SDS-гель (снять концентрирующий гель), и снова три ватмана статей в сэндвич-подобные структуры в полусухого переноса.
4. Применяют 20 В в течение 25 мин.
5. Обнаружение белков в соответствии со стандартными протоколами иммуноблоттинга.

6. Представитель Результаты

Мы представляем анализ эукариотической 19S, 20S, 26S и протеасом в качестве примера для характеристики ПДК в 2D-BN / SDS-PAGE (рис. 1А). НЕК293 лизировали с буфером, содержащим 0,1% Тритон Х-100, как моющее средство сорвать мембран и растворить комплексов мембранных белков. Эти лизаты диализу против БН-диализа буфера для удаления солей и малых метаболитов. Затем, ПДК были разделены 4-15% градиент БН-PAGE затем второе измерение SDS-PAGE. Белки были визуализированы с помощью метода иммуноблоттинга с антителами против субъединиц β2 и Mcp21 из 20S протеасомы.

Рисунок 1. Двумерных BN-PAGE/SDS-PAGE подход с использованием сотовой лизатов. () Принципиальная схема 2D подход BN-PAGE/SDS-PAGE из ячеистого лизатов. (В) Схема схема 2D BN-PAGE/SDS-PAGE. Белки и ПДК разделены под родной условий БН-PAGE в первом измерении. Для второго измерения, белков и / или ПДК денатурированного с помощью ДСН в геле полоса после отделения БН-PAGE и затем подвергают SDS-PAGE. Мономерные белки будут мигрировать в гиперболической диагональные связи с градиентом геля в первом и линейного геля во втором измерении. Компоненты одного конкретного MPC будет найден ниже диагонали, расположенные на вертикальной линии.

Было показано, что сочетание первого измерения БН-и второе измерение SDS-PAGE, мономерные белки мигрировать в гиперболической диагональные связи с градиентом геля в первом и линейного геля во втором измерении ((Камачо Карвахаль, Wollscheid и др. др. 2004);. рис. 1b). Компоненты ПДК расположены ниже этой диагонали. Белки, которые представляют подразделения одного и того же MPC можно найти в одной вертикальной линии во втором измерении, в то время нескольких местах одного и того же белка в горизонтальной линии указывает на наличие белка в нескольких различных ПДК. Рисунок 2 показывает, что в нашем эксперименте иммуноблоттинга против β2 и Mcp21 показал наличие специфических белковых комплексов, содержащих эти протеасомной субъединицы. Оба белка были обнаружены в виде отдельных пятен, расположенных в горизонтальной линией, указывая, что β2 и Mcp21 представляют компоненты нескольких различных ПДК. Эти ПДК можно четко определить как 26S протеасом (20S 19S плюс крышка), 20S протеасомы вместе с регуляторной субъединицы PA28 и 20S протеасом только на основании их размера и состава. Взятые вместе, эти resuLTS продемонстрировать, что эндогенные ПДК могут быть идентифицированы и характеризуется двумерным BN-PAGE/SDS-PAGE подход с использованием сотовой лизат. Этот метод применим для определения размера, состава и относительного содержания ПДК.

Рисунок 2. Обнаружение различных форм эукариот протеасом путем иммуноблоттинга после двумерного BN-PAGE/SDS-PAGE. Для выявления и анализа эукариот протеасом, HEK293 лизировали с 0,1% Тритон Х-100. Сотовая лизаты диализуют и затем подвергают БН-PAGE (4-15%), чтобы отделить ПДК. Впоследствии, второе измерение SDS-PAGE (10%) был запущен на размер разделения отдельных компонентов. Иммуноблоттинг была выполнена со специфическими антителами признании Mcp21 и β2 субъединицы комплекса ядро ​​20С, а регуляторная субъединица PA28.

I. Таблица специфических реагентов (в алфавитном порядке):

II. Таблица конкретных материалов и оборудования:

III. Таблица рецептов:

В этом исследовании мы опишем анализ ПДК по БН-PAGE. 2D подход используется для первого отдельного ПДК в нативных условиях, а затем в дальнейшем разделить их на отдельные компоненты, второе измерение SDS-PAGE.

Образцы готовят из клеточных лизатов. Для растворения многих ПДК, соответствующих моющих средств необходимо, который сохраняет структуру белковых комплексов. Здесь мы используем 0,1% Тритон Х-100. Однако, оптимальное моющее средство и его подходящей концентрации должны быть определены эмпирически для каждого ПДК. В случае Тритон Х-100, например, было сообщено, что низкие концентрации моющего средства позволяют выявлять димерных форм F ₁ F _{0-АТФазы} комплекса (Арнольд, Пфайфер и соавт. 1998). Высшее Тритон Х-100 концентрациях, однако, привести к диссоциации димера и соответствующее увеличение мономерных F ₁ F _{0-АТФазы} комплекса. Это согласуется с одним из наших бывших исследования, были мы покажем, что поливалентные Т-клеточного рецептора комплекса (TCR) сохраняется после извлечения с низкой концентрацией Brij 96, в то время как использование более высокой концентрации или другого моющего средства называются дигитонин результаты в извлечение мономерных TCR (Schamel, Аречаги и соавт. 2005). Часто используемые моющие средства, которые могут быть проверены включают дигитонин (от 0,5 до 1%), Тритон Х-100 (от 0,1 до 0,5%), Бридж 96 (от 0,1 до 0,5%), или dodecylmaltoside (от 0,1 до 0,5%). Эти реагенты неионогенные моющие средства, которые имеют тенденцию быть лучше для стабильности ПДК. Имейте в виду, что контакт с СДС и другие сильные моющие средства следует избегать (Камачо Карвахаль, Wollscheid и соавт. 2004).

Диализ лизатов является необходимой для достижения ПДК разделения в БН-гель (Камачо Карвахаль, Wollscheid и др. 2004 год.); (Хайс, Junkes и др. 2005).. Кажется, что корректировка концентрации соли или удаления низкомолекулярных примесей вес имеет решающее значение для высокого разрешения. Стоит отметить, что также мембранные препараты и ПДК, которые были immunopurified а позже вымывают из антител, пригодных для БН-PAGE (Свами, Siegers и соавт. 2006). В обоих случаях образцы не должны быть диализу для БН-PAGE разделения, если лизис мембраны или элюирования осуществляется в БН-лизис буфера.

Для разделения белков по БН-PAGE, краситель синий Кумасси необходима, который связывается с белками неспецифичным и покрывает их с отрицательными зарядами. Таким образом, Кумасси синим позволяет электрофоретической подвижности белков к катоду при нейтральном рН (Schägger и фон Jagow 1991); (Schägger, Крамер и др., 1994.). Кроме того, Кумасси синий препятствует агрегации белков в концентрирующий гель во время электрофореза. Для БН-PAGE, Кумасси G250 должен быть использован вместо Кумасси синий R250 или коллоидной блюз Кумасси.

Перед запуском БН-гель, необходимо, чтобы процент гель подходит для ожидаемого размера ПДК интерес. Сборный БН-гели с различными градиентами и подходящих буферов являются коммерчески доступными из Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Гель System). Но БН-гели могут быть также получены с использованием градиента смеситель вместе с persistaltic насоса. Чтобы гарантировать нетронутыми градиент, жидкость должна поступать постоянно при разливке и пузыри следует избегать. Мы рекомендуем загрузку различных разведений образца на гель потому что перегрузка может привести к осаждения белка во время электрофореза процесса. Кроме того, БН-гели должны быть запущены при 4 ° С для предотвращения деградации белка и держать ПДК нетронутыми.

После БН-PAGE, визуализация ПДК может быть достигнуто путем Кумасси бриллиантовый синий окрашивания, окрашивания серебром или иммуноблоттинга. Белки полосы визуализировали окрашиванием Кумасси или серебро являются подходящими для дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии (Камачо Карвахаль, Wollscheid и соавт. 2004). В случае иммуноблоттинга, оптимальные условия для передачи ПДК интереса должны быть определены опытным путем. Помните, что Кумасси синий также передается во время блоттинга БН-гель. Таким образом, гель будет бесцветным после успешной передачи, в то время как мембрана будет оказывать синего цвета. Кроме того, важно отметить, что не каждое первичное антитело, которое работает для обнаружения после SDS-PAGE, применимо к иммуноблоттинга на БН-PAGE. Это может случиться, что антитела не признают ПДК интерес, потому что их эпитопа скрыт в родной конформации белков. Чтобы преодолеть эту проблему, можно для денатурации белков в БН-гель до передачи в кипящей геля в скором времени в 1х буфере образец SDS.

В нашем примере, мы не предмет БН-гель непосредственно на обнаружение белка полосы. Вместо этого, мы разделены БН-PAGE разделенных лизат вторым dimensiна SDS-PAGE. Во втором измерении SDS-гель, мономерные белки мигрировать в гиперболической диагональные связи с градиентом геля в первом и линейного геля во втором измерении (Камачо Карвахаль, Wollscheid и соавт. 2004). Это позволяет легко идентифицировать ПДК, так как они локализованы ниже этой гиперболической диагонали. Подкомпоненты одно определенное MPC разделяются в вертикальную линию во втором измерении SDS-PAGE. Компоненты, которые входят в состав нескольких ПДК dinstinct может быть идентифицирован по горизонтальной линии в соответствии с размером ПДК. Тем не менее, он должен учитывать, что несколько мест белков, входящих в одной вертикальной линии может также быть частью отдельных комплексов, которые мигрируют на той же позиции в БН-PAGE. Окончательное доказательство того, что они находятся в том же MPC может быть получена на основе антител методом сдвига геля. В данном анализе сотовой лизат инкубировали с антителами против белка представлен одним из выявленных пятна до БН-PAGE. Это приводит к сдвигу всех ПДК, которые содержат этот белок в направлении более высокой молекулярной массы в первом измерении. Другие белки, которые также являются частью этих ПДК будет проходить этот комплекс конкретных сдвига и, следовательно, легко определить, во втором измерении SDS-гель.

Не только состав ПДК могут быть проанализированы БН-страницы, но также определение их стехиометрии можно (и Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Свами, Minguet и др. 2007 год.). Для этого анализа Namos (родной основе антител мобильности сдвига анализ) может быть выполнена. Как и в основе антител методом сдвига геля, сотовые лизатов инкубировали с моноклональными субъединицы-специфических антител. Это приводит к индукции электрофоретического immunoshifts в БН-гели, которые позволяют вывод из степени переложить на стехиометрии ПДК

В conlusion, БН-страница предназначена для определения ПДК и определение их размера, состава, а также относительное изобилие. Исполняется как анализ Namos, он также предлагает возможность определения стехиометрии определенных ПДК. С учетом его общего применения, этот метод является очень полезным инструментом для характеристики ПДК (Деккер, Мюллер и др., 1996.); (Виттиг и Schagger 2008); (Вагнер, Rehling и др. 2009 год.); (Виттиг и Schägger 2009) .

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы благодарим Майкла Reth, Герман Schägger, и Маргарита Камачо Карвахаль для научной поддержки. Эта работа финансировалась из FORSYS Bundesministerium Fuer Bildung и Forschung (BMBF), по БИОСС из Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), а также при частичной поддержке совершенства Инициатива немецкого федерального правительства и правительств (ГСК-4, Спеманн Высшая школа ).

1. Arnold, I., Pfeiffer, K., et al. "Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits." EMBO J 17(24): 7170-8 (1998).
2. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., et al. "Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach." Mol. Cell. Proteomics 3(2): 176-182 (2004).
3. Heiss, K., Junkes, C., et al. "Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells." Proteomics 5(14): 3614-3622 (2005).
4. Sali, A., Glaeser, R., et al. "From words to literature in structural proteomics." Nature 422: 216-225 (2003).
5. Schägger, H., Cramer, W. A., et al. "Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis." Anal. Biochem. 217(2): 220-30 (1994).
6. Schägger, H. von Jagow, G. "Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form." Anal. Biochem. 199(2): 223-231 (1991).
7. Schamel, W. W. "Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE." J Immunol Methods 252(1-2): 171-4 (2001).
8. Schamel, W. W., Arechaga, I., et al. "Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response." J. Exp. Med. 202: 493-503 (2005).
9. Schamel, W. W., & Reth. M., "Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor." Immunity 13(1): 5-14 (2000).
10. Swamy, M., Minguet, S., et al. "A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes." J Immunol Methods 324(1-2): 74-83 (2007).
11. Swamy, M., Siegers, G. M., et al. "Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes." Sci STKE 2006(345): pl4 (2006).
12. Wittig, I. & Schagger, H. "Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis." Proteomics 8: 3974-3990 (2008).

6 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.