制备鼠尾肌腱的生物力学和Mechanobiological研究

任何操作之前，你必须确定要使用取决于你进行的实验和仪器在您的性格筋组。对于我们而言，腹筋选择，因为他们都较小，因而更容易操纵时，测量的截面积和装修进入生物反应器室。

请注意，所有仪器高压灭菌或用70％乙醇消毒。此外，每个工作站旁放置一个喷雾瓶，含70％乙醇消毒每次操作前实验者手套。

第1部分：提取

尾切除后，仔细地操纵其四肢，以避免损害组织。此外，保护细胞的活力，所有操作都进行了冷盐溶液。

1A）材料：

• 冷盐溶液（D - PBS）
• 碎冰
• 表面保护
• 菜板
• 个人操纵板
• 2 500毫升菜
• 2 2L玻璃菜
• 胶带
• 1镊子
• 1钳
• 1镊子站
• 1对手术剪
• 1手术刀
• 1对手术剪
  
  
  方向识别个人操纵（“P”，“近端” 图1。）

1B）工作站：

1. 摊开的表面保护和砧板放在上面。
2. 填写每两个较大的玻璃菜中途碎冰，并放置在纸张上。
3. 坚持一个磁带上的操纵板的一个角落的一块，并确定了一封信，表明近端。
4. 两个小玻璃中途菜肴和操纵板凹槽填充冷盐溶液。它们放置在含有冰的大玻璃菜。
5. 表面上保护组织的所有消毒。
6. 转移到尾部的玻璃含盐水菜之一。

1C）操作：

1. 尾部近端的解剖观察，以区别于背侧腹侧。腹侧有一个数量较大的肌腱和血管，可轻轻挤压尾部产生微小的血液滴核实。
2. 使用的手术剪，切沿尾部背侧皮肤，如果你想提取的腹筋（或沿腹端，如果您需要背筋）。
3. 打开切口近端和删除通过精心操纵尾部两端使用产钳或手指和皮肤。
4. 在盐溶液的血液和头发用清水冲洗干净，并转移到剩余的玻璃盘包含新鲜的溶液试样。更换手套。
   
   光显微镜下观察显示了一个横向的第6个肌腱组。一位来自各组肌腱是连接到每个椎体的尾部结束，因此，我们在椎间盘切揭露新的肌腱沿切割。
   
   
   图2横向光学显微镜下观看了鼠尾节。
5. 穿过软骨2-3椎体手术剪短的末端。放在砧板上的尾巴，削减使用手术刀，然后立即在解决方案取代的软组织。
6. 使用镊子，从远端尾部拉出一个肌腱。
7. 在两端的温柔举行，放入个人操纵板的肌腱​​。
   
   重复最后两个步骤，直到没有更多的筋可以梳理出切椎较短时，新的组织需要公开的。

第2部分：截面积测量⁷

当组织发生机械特性或刺激，其机械性能正常化内肌腱的力量，强调。这就是为什么我们评估的横截面面积。

2A）材料：

• 光学测微计
• 体视显微镜
• 数码相机
• 边缘识别和简介重建算法^5,6
• 冷盐溶液（D - PBS）
• 1 20 -200μL微量移液器
• 1光纤微米调整的六角扳手
• 2镊子
  
  / files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg“ALT =”图3“/>
  图3光纤千分尺。

2B）工作站：

1. 打开软件（数码相机和算法）。
2. 将光纤微米，以便有足够的空间来装载在仪器的肌腱。
3. 组织的工具和玻璃盘提取筋近在咫尺。

2C）操作：

1. 冷盐溶液填充测量车厢，直到两个锚系统被淹没。
2. 拿着镊子的两端的肌腱转移到车厢。
3. 通过微量移液器吸，拉硅管在同一时间进入一个肢体。吸，直到最后超出了固定环延伸。
4. 拧紧固定环，压缩管，并安装在立体显微镜下仪器。
5. 105X的放大倍率，同时观察组织，直到的折痕不再感知舒展筋。通过“额外的0.40％。
   
   
   图4。投影105X的放大倍率和拉伸后肌腱。
6. 调整位置和重点，以保持一个清晰的图像超过180 °旋转肌腱。
7. 以每10 °旋转的照片，无需修改紧张，焦点或位置。仅使用旋转轴进行旋转。由于它的圆锥形，这些步骤可能会重复沿肌腱的不同点。
8. 激活边缘识别和轮廓重建算法，以分析您已注册的数据库。
9. 免费肌腱松开固定环和使用的硅微量移液器管空气吹。
10. 重新插入到操纵板肌腱，再处理完。
11. 验证取得的个人资料重建和横截面积的价值的形状。

第3部分：清洗

要删除以前的操作过程中可能发生的污染，组织生物安全柜下冲洗。

3A）材料：

• 冷盐溶液（D - PBS）
• 多槽操纵板
• 个人操作板
• 胶带
• 2镊子
• 1镊子站

3B）工作站：

1. 提前打开风扇在生物安全柜15分钟和清洁的内表面用70％乙醇。
2. 带内的生物安全柜中的所有文书。
3. 坚持到一个角落的每一个人板件的磁带，以确定近端。
4. 用无菌生理盐水溶液填充凹槽。

3C）操作：

1. 介绍操纵板，包含在内阁中提取肌腱。
2. 使用镊子，取出其板块的把握上，每年年底的温柔的肌腱。
3. 沉浸和多槽操纵板的每个车厢的盐溶液中轻轻搅动，肌腱，从最近开始，出发到最远的凹槽。
4. 最后，淹没在一个单独的操纵板肌腱。

第4部分：载入到生物反应器室

为了避免进一步污染，以下操作都是在生物安全柜中进行。

4A）材料：

• 生物反应器室⁴
• 无菌锚
• 1无菌培养皿
• 冷战细胞培养培养基（DMEM）
• 瞬干胶
• 2镊子
• 镊子立场
• 0.5 -10μL微量移液器
• 1标尺
  
  
  生物反应器腔图5。

4B）工作站：

1. 由于在生物安全柜，也实现了上一步，删除不必要的工具会给你更多的工作空间。
2. 使机柜内的所有其他文书。

4C）操作：

1. 操纵盘集中在肌腱下肢和伤口组织其阀芯阀芯周围放置在一个锚。
2. 卷锚，并保持宽松的肢体，同时确保组织保持锚。 ¾转动后停止。
3. 进行相同与另一端的步骤。
4. 翻转同样两个锚，直到有6厘米之间的^中心 1 。
5. 松开肌腱沉浸在解决方案，并允许挂靠部分简要干，以提高其机械性能^2-3。
6. 倾入培养皿氰基丙烯酸酯，并绘制成的微量移液器2.5μL。
7. 在盐溶液中滴加任何胶水适用无伤口组织的氰基丙烯酸酯的下降。重复，直到2滴已应用到每个锚。
8. 随着肌腱仍然完全浸入，等待5分钟胶水完全干燥。
9. 在这段时间里，装满盐水的腔室。
10. 所有组织补充水分与盐溶液，以防止损坏。
11. 通过操纵只锚，转移到生物反应器室的肌腱和关闭，以防止在传输过程中的泄漏和污染。

第5部分：代表性的成果：

该协议的结果显示，当正确执行，我们的组织严密的隔离和编制程序，使人们有可能保持组织的不育性，可行性和完整性。

首先，使用简单，重复提取方法，我们能够提取不破坏的胶原蛋白网络，因为它可以由H＆E染色后提取意识到污染的部分微观分析观察的尾部筋。

图6。提取后肌腱的胶原蛋白网络（5μm的纵切面与H＆E染色） 。

然后，我们培养长达10天，并进行无菌测试的筋。每一天，我们镀使用琼脂培养液，孵育24小时。由于无细菌生长观察，我们得出的结论，我们的操作不会造成污染。

随着文件重建算法和光纤微米，我们能够估计在一个错误⁷ 2％的保证金的横截面积。

图7。个人资料重建的RTT。

最后，我们评估使用后冲洗的步骤，并经过12天的文化时期的哺乳动物细胞的活/死可行性/细胞毒性试剂盒的可行性。由于绿色荧光活细胞大部分是很明显的的，我们可以证实，我们的隔离程序，成功地保持活组织。同样的测试，安装好后，进入生物反应器室的肌腱进行了两个小时。我们核实，脱水和胶锚没有在两个锚之间的组织传播。

图8。组织在锚可行性（绿色=活细胞，红色=死细胞）

通过应用这些实验程序，我们可以进行这样的组织在体外研究了多种。例如，组织变性的研究进行了为期10天的RTT的刺激下的应用程序。每一天，我们评估组织的力学性能，在非破坏性应力松弛试验。最后，我们能够观察到的RTT的应力变化，从而分析力学性能的进展。

图9。内河码头的应力变化评估槽松弛试验（1到10天）。