Подготовка Мышь гипофиза Иммуноген для индукции экспериментального аутоиммунного гипофизит

Экспериментальный протокол

Первым шагом в этом протоколе исследования является сбор большого количества мыши желез гипофиза. Второй шаг заключается в гомогенизации желез подготовить белков экстракта. Третий шаг состоит в эмульсию этих белков с жирной смесью.

Шаг 1: Сбор и хранение мыши гипофиза

Мышь гипофиз находится у основания черепа в депрессию клиновидной кости называют турецкого седла, в окружении бокам тройничного нервов и кпереди от зрительных нервов. Железа состоит из передней доли больших и меньших задней и промежуточной долях, и весит в среднем 1,9 мг. Гипофиза собираются от мышей смешанных штаммов, полов и возрастов, суждено быть умерщвлены с установкой, ухода за животными.

Для выделения гипофизом, мышь эвтаназии, кожу над черепом рассеченные, и кости черепа разрезать ножницами. Мозг поднимается подвергать гипофиза, который затем изолированы от окружающего твердой мозговой оболочки, зачерпнул из клиновидной кости и хранится в пластиковой трубки на сухом льду.

В целом мы используем 300 мышь гипофиза для одного белкового препарата, число, которое может быть собрана одним человеком в 9 часов.

После коллекции будет завершена, трубки, содержащей гипофиза хранится при температуре -80 ° С до готовности для следующего шага.

Шаг 2. Добыча мыши гипофиза белков

1. Добавить гомогенизации буфер для 15-мл Сокол трубки (каталог не 352 059) держали в ледяной ванне, с помощью 250 мкл буфера на каждые 100 гипофиза собраны. Использование буфера ионной силы похож на тот, который является физиологически присутствующий в цитоплазме клетки (0,2 М) и физиологических рН (7,4). Мы используем фосфатным буферным раствором (0,161 М, рН 7,4), дополненные коктейль ингибиторов протеаз (Sigma-Aldrich, каталог не P8340-1мл).
2. Добавить гипофиза в буфер перед гомогенизации, а затем поместить генератор (5-мм диаметр) Polytron гомогенизатор на дне пробирки Falcon. Однородный при максимальных оборотов в минуту в течение 30 секунд, плавно перемещая трубку Сокол вверх и вниз, держа его в ледяной ванне. Затем, отдых гомогената на льду в течение 1 мин. Повторите гомогенизации и охлаждения шаги еще два раза. Этот нежный гомогенизации должна сломаться клеток и высвобождение цитозольного белки, не нарушая ядер.
3. Для удаления ядер, непрерывной ткани и нерастворимых материалов (например, соединительной ткани и денатурированные белковые комплексы), центрифуги гомогената на низкой скорости (1000 г) в течение 10 мин при 4 ° C.
4. Передача супернатант (сейчас он называется пост-ядерном Супернатант, ПНС) в новую пробирку Falcon, заботясь, чтобы оставить нетронутой гранул, и хранить ПНС на льду.
5. Ресуспендируют пеллет в первоначальный объем гомогенизации буфере (250 мкл буфера на каждые 100 гипофиза собраны), гомогенизации, как выше, центрифуги, как выше, а затем объединить второй ПНС с первой.
6. Алиготе два объединения ПНС образцов в микроцентрифужных труб и хранить при температуре -80 ° С до готовности для следующего шага. Этот белковый препарат можно хранить при температуре -80 ° С, но постепенно теряет свою силу, поэтому мы рекомендуем использовать его в течение 6 месяцев с подготовки. Используйте небольшие аликвоты, чтобы определить выход белка и концентрации анализа BCA (Пирс каталога нет. 23225), и качество белка помощью гель-электрофореза. В общем, мы получаем около 60 мг белка от 300 гипофиза мыши в 1,5 мл буфера гомогенизации, при концентрации около 40 мг / мл.

Шаг 3. Подготовка эмульсии для иммунизации

1. Оттепель быстро замороженные порции белка, необходимого для эксперимента и регулировать концентрации белка до 20 мг / мл. Этот белок экстракт будет эмульгированных 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (CFA, Sigma F-5881), содержащий 5 мг / мл тепла убитых микобактерий туберкулеза (Becton Dickinson, 231141). Каждая мышь будет получать по 1 мг экстракта гипофиза в 100 мкл эмульсии.
2. Пример, приведенный ниже, предназначена для иммунизации 10 мышей, где каждая мышь будет вводили 100 мкл эмульсии, содержащей 1 мг гипофиза белков. Разрешить два дополнительных мышей материальных потерь в период подготовки, так что используйте 12 мг гипофиза белков. Aspire 600 мкл 20 мг / мл гипофизарный экстракт белка описать выше, используя 2,5 мл Гамильтон газонепроницаемый шприц. Ресуспендируют CFA от сотрясения, и стремятся 600 мкл CFA в другой шприц 2,5 мл Гамильтон. Присоединение и безопасный 22 калибра микро-эмульгирующей иглу шприц с КФА. Медленно нажмите на поршень шприца КФА, что игла наполняется CFA, затем приложите и безопасной другой конециглы для шприц с экстрактом гипофиза.
3. Медленно поршень шприца CFA толкать нефть компонента в acqueous гипофизарный экстракт, например, что только небольшое количество носит смешанный характер. Затем отодвинуть поршень шприца экстракта гипофиза в шприц КФА. Повторите это действие постепенно увеличивая количество материала, смешанный. Продолжайте, пока все содержимое два шприца носят смешанный характер. Вы получите беловатые и равномерно распределенное решение, которое представляет водно-нефтяной эмульсии.
4. Как только образуется эмульсия, повторите возвратно-поступательное движение по меньшей мере 500 раз, чтобы гарантировать эмульсии тщательно перемешивают. После окончательного смешивания цикла, 1:01 водно-масляная эмульсия готова к использованию и содержит гипофиза концентрации белка 10 мг / мл. Эмульсии будут внесены в тот же день подкожно в анестезии SJL мышей, как указано в статье Юпитеру спутник.

Несмотря на то что первый пациент с аутоиммунными гипофизит сообщалось, в 1962 году ^4, патогенных гипофиза аутоантигенов еще предстоит идентифицировать ^5. Экспериментальные модели на животных могут быть очень полезны в выявлении таких аутоантигенов, содействие открытию биомаркеров, которые переводимые в лечении пациентов. Эта статья продемонстрировала простой процедуры подготовки гипофиза белков в форме, адекватной для индуцирования аутоиммунных гипофизит у экспериментальных животных.