The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Department of Pathology, The Johns Hopkins University
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Landek-Salgado, M. A., Tzou, S., Kimura, H., Caturegli, P. Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice. J. Vis. Exp. (46), e2182, doi:10.3791/2182 (2010).
Autoimmune hypophysitis पिट्यूटरी अतिसंवेदनशील 1 चूहों में एक सहायक के साथ मिश्रित प्रोटीन के इंजेक्शन द्वारा प्रयोगात्मक reproduced किया जा सकता है. माउस मॉडल हमें अध्ययन करने के लिए कैसे रोगों उधेड़ना अनुमति देते हैं, अक्सर ही मनुष्यों में होने वाली प्रक्रियाओं का एक अच्छा प्रतिकृति प्रदान. प्रकार 1A मधुमेह जैसी कुछ autoimmune रोग, के लिए, (इशारा माउस) मॉडल है कि अनायास एक मानव समकक्ष के समान रोग विकसित कर रहे हैं. कई अन्य autoimmune रोग के लिए, तथापि, मॉडल प्रयोगात्मक प्रेरित किया जा जरूरत है. इस संबंध में एक आम दृष्टिकोण के एक प्रमुख अंग से अध्ययन किया जा रहा प्राप्त प्रतिजन के साथ माउस इंजेक्षन है. उदाहरण के लिए, autoimmune thyroiditis में रुचि जांचकर्ताओं 2 thyroglobulin के साथ चूहों इंजेक्षन, और उन myasthenia ग्रेविस में रुचि रखते उन्हें acetylcholine रिसेप्टर के साथ 3 इंजेक्षन. यदि एक विशेष autoimmune रोग के लिए autoantigen ज्ञात नहीं है, जांचकर्ताओं autoimmune प्रतिक्रिया द्वारा लक्षित अंग से एक कच्चे प्रोटीन निकालने इंजेक्षन. Autoimmune hypophysitis के लिए, रोगजनक autoantigen (ओं) 4 की पहचान हो रहते हैं, और इस प्रकार एक कच्चे पिट्यूटरी प्रोटीन तैयार करने में प्रयोग किया जाता है. हम इस वीडियो लेख में प्रदर्शन कैसे SJL चूहों में प्रयोगात्मक autoimmune hypophysitis प्रेरित करने के लिए.
प्रायोगिक प्रोटोकॉल
एक बार पिट्यूटरी immunogen (साथी लेख देखें) तैयार है, यह subcutaneously SJL (जैक्सन प्रयोगशालाओं, स्टॉक 000686) चूहों में इंजेक्ट किया है. एक दूसरा समान इंजेक्शन 7 दिनों के बाद दोहराया है. चूहे तो vivo और पोस्टमार्टम परिणामों में इकट्ठा किया जाता है.
चरण 1. पिट्यूटरी immunogen SJL चूहों में चमड़े के नीचे इंजेक्शन
चूहे पहली बार 20 मिलीग्राम / एमएल 2,2,2-Tribromoethanol के 0.5 मिलीलीटर (Avertin, TCI अमेरिका, टी 1420) intraperitoneally इंजेक्शन द्वारा anesthetized हैं. चूहे तो पिट्यूटरी पायस कि है, के रूप में साथी में संकेत 2181 लेख जौव के 100 μl subcutaneously इंजेक्शन, पिट्यूटरी निकालने और पूरा Freund सहायक के 0.25 मिलीग्राम के 1 मिलीग्राम शामिल हैं. पायस बाईं पृष्ठीय हिंद पैर (क्षेत्र (50 μL) और सही वंक्षण क्षेत्र (50 μL) में इंजेक्ट किया है पिट्यूटरी पायस फिर से 7 दिन पर विपरीत (सही पृष्ठीय हिंद पैर क्षेत्र में 50 μl और साइटों में अंतःक्षिप्त है. बाईं वंक्षण क्षेत्र में 50 μl). चूहे दैनिक के पहले 3 दिनों के लिए निगरानी कर रहे हैं और फिर बलिदान है, जो आम तौर पर पहली प्रतिरक्षण के बाद 28 दिनों के दिन तक साप्ताहिक.
चरण 2. Vivo परिणामों में का संग्रह: रक्त assays
सबसे अधिक प्रायोगिक परिणामों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जबकि चूहों अभी भी जीवित हैं ऊतक रक्त है. रक्त नियमित रूप से 14 दिन पहले प्रतिरक्षण के लिए पिट्यूटरी एंटीबॉडी या साइटोकिन्स और chemokines की तरह अन्य मार्करों के सीरम स्तर को मापने के बाद तैयार की है.
रक्त के रूप में रहते चूहों से एकत्र किया जाता है. चूहे सुरक्षित गर्दन के कूड़ा द्वारा आयोजित कर रहे हैं और जबड़े की हड्डी के पीछे स्थित है. एक बार जबड़े की हड्डी के पीछे स्थित है, 4 मिमी lancets छेद अवअधोहनुज संवहनी बंडल किया जाता है. रक्त एकत्र होने के बाद क्षेत्र पर दबाव जगह एक शराब झाड़ू का उपयोग करने के लिए एक रक्तगुल्म से बचने. एकत्र रक्त के 20 मिनट के लिए 2,000 ग्राम पर centrifuged है, और -80 डिग्री सेल्सियस जब तक इस्तेमाल किया पर संग्रहीत.
चरण 3. पोस्टमार्टम परिणामों का संग्रह: पिट्यूटरी ऊतकविकृतिविज्ञानी
चूहे आम तौर पर पहले टीकाकरण के बाद 28 दिनों का बलिदान कर रहे हैं. कार्डिनल EAH के निदान की स्थापना के लिए आवश्यक सुविधा hematopoietic mononuclear कोशिकाओं द्वारा पिट्यूटरी ग्रंथि की घुसपैठ है.
चूहे उन्हें है कि सीओ 2 के साथ perfused है एक मोहरबंद प्लास्टिक चैम्बर में रखकर euthanized हैं. चूहे 8 मिनट की कुल के लिए चैम्बर में रखा जाता है. इच्छामृत्यु के बाद, पिट्यूटरी ग्रंथि एकत्र किया जाता है के रूप में साथी लेख में वर्णित है. एक रोगग्रस्त पिट्यूटरी ग्रंथि सूजन और अधिक मजबूती से आसपास dura मेटर के अनुयायी प्रकट होता है. तीव्र संदंश पिट्यूटरी आसपास meninges ढीला करने के लिए उपयोग किया जाता है. फन्नी के आकार की हड्डी पर एक बार पिट्यूटरी स्वतंत्र रूप से चलता है, पिट्यूटरी ग्रंथि के एक छोर संदंश के साथ समझा जाता है और पिट्यूटरी ग्रंथि को ध्यान से उठाया है. ग्रंथि तो एक microcentrifuge Beckstead लगानेवाला 5 युक्त ट्यूब में रखा गया है . पिट्यूटरी ग्रंथि रात तय है, लेंस कागज में लपेटा, और एक कैसेट में रखा. ग्रंथियों तो निम्न प्रोटोकॉल का उपयोग संसाधित कर रहे हैं:
| स्टेशन संख्या | अभिकर्मक | मिनट में समय | तापमान (सेल्सियस) |
| 1 | 70% शराब | 5 | 25 |
| 2 | 70% शराब | 15 | 25 |
| 3 | 95% शराब | 15 | 25 |
| 4 | 95% शराब | 15 | 25 |
| 5 | 100% शराब | 15 | 25 |
| 6 | 100% शराब | 7.5 | 25 |
| 7 | 100% शराब | 7.5 | 25 |
| 8 | xylene | 20 | 25 |
| 9 | xylene | 20 | 25 |
| 10 | xylene | 25 | |
| 11 | तेल | 30 | 58 |
| 12 | तेल | 5 | 58 |
| 13 | तेल | 5 | 58 |
प्रसंस्करण के बाद, आयल में पिट्यूटरी ग्रंथि एम्बेडेड रहे हैं और कम से कम 5 nonconsecutive वर्गों (मोटी 5 सुक्ष्ममापी) प्रत्येक ग्रंथि से काट रहे हैं. सेक्शनिंग के बाद, ग्रंथियों hematoxylin और eosin के साथ दाग रहे हैं, और mononuclear घुसपैठ यों विश्लेषण. स्कोरिंग के लिए सबसे गंभीर घुसपैठ के साथ अनुभाग चयनित है. गंभीरता पूर्वकाल पिट्यूटरी या प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा प्रतिस्थापन विनाश की हद तक के एक व्यक्तिपरक अनुमान के आधार पर रन बनाए है: ग्रेड 0, कोई रोग, 1 ग्रेड, 2% -20% की भागीदारी, 2 ग्रेड, 20% -30%, 3 ग्रेड, 30% -50%; 4 ग्रेड, 50% -90%, ग्रेड 5, 90% से अधिक. सभी वर्गों के दो वर्गों के स्रोत के लिए अंधा व्यक्तियों द्वारा रन बनाए हैं.
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चार तकनीकों प्रयोगात्मक पशुओं में hypophysitis प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया है. इस आलेख में वर्णित तकनीक, कि पिट्यूटरी एस Freund सहायक के साथ मिश्रित प्रोटीन के इंजेक्शन है सबसे पुराना एक, वापस +१९६७ 6 डेटिंग है, और अधिक से अधिक 1 हाल ही में सुधार किया गया है . अन्य तकनीकों 7 +१,९९२ में घुलनशील रूबेला वायरस glycoproteins के इंजेक्शन, एक adenovirus के stereotactic 8 +२००२ में पिट्यूटरी ग्रंथि में सीधे इंजेक्शन, और अन्य चूहा तनाव के गुर्दे कैप्सूल के तहत 9 2010 में एक चूहा तनाव से पिट्यूटरी ग्रंथियों के प्रत्यारोपण . Freund सहायक दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि यह कम इनवेसिव, और अधिक सुसंगत और सब से ऊपर, एक रोग है कि निकट मानव समकक्ष जैसा दिखता है उत्प्रेरण में सटीक है. इस वीडियो लेख में वर्णित तकनीक पैदावार hypophysitis की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल है, जो जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है इस आकर्षक रोग की हमारी समझ में सुधार.
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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
यह काम NIH अनुदान DK080351, पीसी के लिए और टेरी और Kristine गोर परिवार के एक उदार उपहार द्वारा समर्थित किया गया.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
