Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

1. Statico Co-cultura Biofilm Modello

1. La statica Co-cultura Modello Biofilm ¹ usa CFBE41o-cellule (cellule CFBE), che sono immortalate le cellule originariamente sviluppato da un individuo con omozigote CF per il ΔF508-mutazione CFTR ^2,3,4. Cellule CFBE dovrebbe essere seminate ad una concentrazione di 10 ⁶ cellule / pozzetto in un 6-pozzetti di coltura o 2 x 10 ⁵ in un 24-pozzetti coltura tissutale in minima quantità di terreno essenziale (MEM) arricchito con 10% di siero fetale bovino, 2mM L-glutamina, 50 U / mL di penicillina, e 50 mg / mL di streptomicina. Noi usiamo 1,5 ml di mezzo per pozzetto in piastre da 6 bene e 0,5 ml di mezzo per pozzetto in piastre da 24 pozzetti.
2. Le cellule devono essere coltivate a 37 ° C e _5% di CO2 -95% di aria per 7-10 giorni per formare un monostrato confluente prima inoculazione di batteri. Il mezzo deve essere cambiato ogni 2-3 giorni. Queste condizioni hanno dimostrato di portare alla formazione di un monostrato confluente e giunzioni strette.
3. Crescere P. aeruginosa in 5 LB mL per 18 ore a 37 ° C in un agitatore incubatore a 200 giri al minuto. In queste condizioni, P. culture aeruginosa in genere raggiungono una densità di 5x10 ⁹ CFU / ml.
4. Per l'inoculazione dei batteri, rimuovere il terreno dalle cellule CFBE e aggiungere un uguale volume di MEM senza rosso fenolo, integrato con 2 mM L-glutammina (medio Microscopy). CFBE monostrati confluenti vengono inoculate con P. aeruginosa in una molteplicità di infezione di circa 30:1 rispetto al numero di cellule CFBE originariamente seminati. Ciò equivale a 2 x 10 ⁷ CFU / ml in 1,5 ml di MEM / bene per 6 pozzetti e 1,2 x 10 ⁷ CFU / ml in 0,5 ml di MEM / bene per 24-pozzetti.
5. Incubare le piastre per 1 ora a 37 ° C e 5% -95% _di CO2 nell'aria.
6. Dopo l'incubazione 1 ora, il sopranatante deve essere rimosso e sostituito con medium fresco Microscopia integrato con 0,4% arginina.
7. Incubare a 37 ° C e _5% di CO2 -95% aria per intervalli di tempo diversi (fino a circa 8 ore) e analizzare l'integrità del monostrato CFBE utilizzando il microscopio a contrasto di fase. Se le cellule delle vie aeree non sono confluenti, P. aeruginosa saranno rapidamente (pochi minuti) di accedere alla superficie basolaterale delle cellule e distruggere l'integrità cellulare. Inoculazione con P. aeruginosa, i ceppi che esprimono costitutivamente risultati GFP in microcolonie biofilm fluorescente che può essere visualizzato mediante microscopia in epifluorescenza e confocale.
8. Il CFU batteriche nel biofilm può essere determinato lavando la co-coltura 2-3 volte con tampone fosfato salino (PBS) per eliminare i batteri planctonici. Dopo il lavaggio, trattare con 0,1% Triton X-100 in PBS o MEM per 10-15 minuti per lisare le cellule epiteliali e disperdere il biofilm.
9. Vortex per 3 minuti e preparare diluizioni seriali del lisato. Piastra di queste diluizioni su agar LB ed incubare una notte a 37 ° C. Contare le colonie il giorno seguente per determinare il CFU.

2. Cella di flusso co-cultura Biofilm Modello

1. La cellula di flusso co-cultura Modello biofilm (test portata) comporta la modifica dello standard apparato cella a flusso biofilm per ospitare le cellule CFBE ^5.
2. Luogo diversi coprioggetto di 40 mm di diametro in un bicchiere pulito becher da 100 ml. Coprire bene con 2 strati di fogli di alluminio e autoclave su un ciclo a secco per 20 minuti.
3. Lavorare in una cappa di coltura cellulare, afferrare uno coprioggetti sterile dal bicchiere con pinze etanolo lavato e posto in una sterile di 60 mm di diametro piatto di plastica.
4. Aggiungere 3 ml di pre-riscaldato media la crescita delle cellule, premendo sul vetrino con la punta della pipetta per rimuovere eventuali bolle intrappolate sotto e per forzare il coprioggetto sul fondo del piatto di plastica.
5. Semi di 2x10 ⁶ celle per ogni piatto e agitare il piatto leggermente avanti e indietro. Evitare vorticoso per evitare centrifugazione le cellule contro i lati del piatto.
6. Porre la capsula in un 5% di CO ₂ -95% incubatore d'aria a 37 ° C e di alimentare le celle a giorni alterni con 3 ml di mezzo di crescita fresco per 8 a 10 giorni. Le cellule di formare un monostrato confluente sul coprioggetto di vetro.
7. Crescere P. aeruginosa in 5 ml di LB per 18 ore a 37 ° C in un agitatore incubatore a 200 giri al minuto. In queste condizioni, P. culture aeruginosa in genere raggiungono una densità di 5x10 ⁹ CFU / ml. Noi usiamo P. PAO1 ceppo aeruginosa portando il pSMC21 plasmide per l'espressione costitutiva della GFP ^6.
8. Aggiungere 1 ml di coltura batterica in una provetta sterile. Centrifugare a 6000 rpm per 3 min, e lavare il pellet batterico due volte in 1 ml di terreno Microscopia.
9. Diluire 0,5 ml di batteri lavate e risospese in 4,5 ml di mezzo di microscopia per ottenere una concentrazione di circa 5x10 ⁸ CFU / ml.
10. Osservazione di cellule vivein tempo reale richiede una camera di imaging accoppiato ad una pompa peristaltica (per garantire un flusso di nutrienti per periodi di tempo) e un regolatore di temperatura. Usiamo il FCS2 Bioptechs (Focht Live-Cell) camera collegata ad un basso flusso di micro-perfusione pompa con 1 / 16 ^° C-flex taglio tubi di lunghezza appropriata e autoclave per la sterilità, e la temperatura regolata tramite il controller della camera FCS2. Manteniamo la fonte di ingresso di media in un bagno d'acqua a 37 ° C situato proprio accanto al microscopio.
11. Montare la camera di flusso. La camera di FCS2 comprende un autobloccante base (che si siede sul palco durante l'adattatore di imaging) e di una metà superiore collegato ai tubi perfusione e il controller della camera. La camera è montata a testa in giù prima di essere capovolto e posizionato sull'adattatore palco. Tenere la parte superiore della camera a testa in giù in modo che i tubi di perfusione sono visibili, e allineare i fori di distanza di una guarnizione in gomma pari a 0,75 mm di spessore sul tubi di perfusione. Pila la diapositiva microaqueduct fornito con la camera in cima alla guarnizione in gomma, assicurandosi che il lato scanalato è alto, e posto un altro guarnizione in gomma sulla parte superiore della diapositiva. Lo spessore e la geometria interna di questa seconda guarnizione determinerà il volume della camera. Noi di solito lavorare con un 0,75 mm di spessore con guarnizione in gomma da 30 mm geometria tondo interno.
12. Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) media Microscopia al centro della diapositiva.
13. Recupero di una 60 mm piatto dalla cella cultura incubatore, rimuovere il supporto spesi e lavare le cellule una volta con 3 ml di pre-riscaldato medio Microscopia. Questo passaggio garantisce l'eliminazione del rosso fenolo e antibiotici presenti nel terreno di coltura delle cellule. Rosso fenolo è leggermente fluorescente e può interferire con le immagini, mentre gli antibiotici possono sradicare P. aeruginosa batteri prima di poter stabilire biofilm.
14. Utilizzando etanolo lavato pinze, recuperare il coprioggetto dal piatto e basso a testa in giù sul tallone di media Microscopia posto sulla camera. Il coprioggetto è ora di riposo sulla guarnizione in gomma secondo e il monostrato di cellule delle vie aeree è rivolto verso il basso.
15. Tenendo i componenti assemblati in una mano, posto alla base della camera in cima alla pila, e girare la camera di sopra rapidamente in modo che tutto sia lato destro alto. Bloccare la base in posizione ruotando l'anello.
16. Collegare il tubo di ingresso al basso flusso di micro-perfusione pompa e avviare il flusso a una velocità di 20 ml / h; questa portata è alla portata di nuoto velocità di P. aeruginosa. Un secondo pezzo di tubo della pompa link ad un fiasco di media Microscopia posto nel bagno d'acqua a 37 ° C situato proprio accanto al microscopio.
17. Allega sterile pre-tagliati 1 / 16 ^° C-Flex tubi di aspirazione e tubi di perfusione uscita della camera, collegare il regolatore di temperatura, poi posto la camera montata sul palco microscopio di un microscopio invertito a fluorescenza.
18. Utilizzando un 1-ml siringa monouso, iniettare la sospensione batterica precedentemente preparato nella camera, utilizzando una valvola a due vie posto in linea tra la pompa e la camera. Nel nostro ambiente particolare, ci vuole un volume di 0,6 ml di sospensione batterica per raggiungere la camera. Regolare il volume in base alle proprie lunghezza del tubo particolare. Troviamo anche utile porre un filtro in linea monouso 0,22 micron filtro tra la pompa e la valvola a due vie per impedire ai batteri di nuoto controcorrente e contaminando il pallone d'ingresso.
19. Per consentire ai batteri di attaccare le cellule delle vie aeree, fermare la pompa per 2h. Il flusso può poi ricominciare e mantenuta a 20 ml / h per il resto l'esperimento.
20. Monitorare l'integrità delle cellule delle vie aeree per contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopia tutto l'esperimento per verificare eventuali segni di danni al monostrato. Allo stesso tempo, seguire lo sviluppo della GFP-etichettata P. aeruginosa biofilm sulla superficie apicale delle cellule delle vie aeree con l'acquisizione di immagini con un microscopio invertito a fluorescenza o confocale a grande campo.

3. Rappresentante Risultati

Usiamo un ceppo di P. aeruginosa pSMC21 contenente il plasmide che permette di espressione costitutiva di GFP ^6. Per questo motivo, GFP-etichettata biofilm cresce su un monostrato CFBE possono essere visualizzati mediante microscopia in epifluorescenza. In alternativa, la visualizzazione del biofilm può essere raggiunto con la colorazione senza etichetta P. aeruginosa con un 1% di soluzione calcofluor bianco per 1 ora a 37 ° C ^1.

Per la formazione di biofilm immagini sulle cellule CFBE nel test di flusso, si usa una misura adattatore stadio, ma più aziende possono ora fornire adattatori palco appositamente montato. Lavoriamo con un microscopio Olympus IX70 invertito dotato di un ORCA-AG profondo raffreddamento telecamera CCD e un olio x60-immersion obiettivo (apertura numerica 1,40). Il filtro wtallone è equipaggiato con un filtro di banda 480/40 nm di eccitazione e di un passaggio 535/30 nm filtro passa-banda di emissione. Le immagini digitali sono state acquisite con il pacchetto software 4.0.3 OpenLab (improvvisazione) ei volumi sono stati deconvolved da iterativo di restauro utilizzando il software 3.5.1 Volocity (improvvisazione). Analisi quantitativa delle strutture biofilm 3D è stato raggiunto con il pacchetto software di analisi dell'immagine COMSTAT ^7,8.

Per qualsiasi co-coltura modello considerato, si deve prestare particolare attenzione alla citotossicità sviluppo tra i componenti del modello. In entrambi i test statici e il flusso delle cellule, abbiamo scoperto che il monostrato CFBE potrebbe sopportare la presenza di P. aeruginosa fino a 8 ore dopo l'inoculazione, senza alcun segno di alterazione. Integrità monostrato epiteliale può essere valutata in contrasto di fase microscopio utilizzando un microscopio invertito ¹ (Figura 1A) o da interferenze contrasto differenziale (DIC) microscopia tutto l'esperimento ^5. Nel corso del tempo, P. aeruginosa produce tossine e fattori di virulenza che si accumulano e possono danneggiare il monostrato di cellule epiteliali in tutto o in sezioni (Figura 1B-1C). Citotossicità può essere valutata quantitativamente con vari kit per misurare il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) dalle cellule epiteliali. LDH è un enzima citosolico stabile rilasciata nell'ambiente extracellulare su lisi cellulare o morte cellulare.

Quando l'integrità del monostrato vie aeree non è compromessa (tipicamente per ~ 8 ore dopo l'inoculazione), P. biofilm aeruginosa possono formare e sviluppare con successo sulla superficie apicale delle cellule delle vie aeree sia in co-coltura modelli descritti (Figura 2A-2B). A seguito di ricostruzione 3D (Figura 2C) e la quantificazione, l'accumulo di biomassa può essere accuratamente determinato. Abbiamo anche utilizzato questi co-coltura biofilm in diversi test fenotipici. Per esempio, come già detto, biofilm CFU può essere facilmente determinata dalla lisi delle cellule epiteliali, in serie diluire il lisato, e placcatura su piastre di agar. Abbiamo trovato questa tecnica vantaggiosa nel determinare la resistenza di diversi ceppi di trattamento antibiotico. Inoltre, la tossicità biofilm verso le cellule epiteliali può essere misurato utilizzando disponibili in commercio kit di rilevazione LDH. In questo modo, il ruolo dei fattori di virulenza della tossicità dei biofilm può essere valutata. Questi sistemi di modelli supportano anche una serie di applicazioni di espressione genica, compresi gli studi fusione promotore, RT-PCR e analisi microarray ^1,5,9.

Figura 1. Monostrato di cellule CFBE e immagini rappresentative di compromesso e danneggiato monostrati di cellule delle vie aeree a causa di P. aeruginosa crescita biofilm. (A) immagine rappresentante di un monostrato di cellule confluenti CFBE coltivate in piastre di coltura tissutale, valutata in contrasto di fase microscopia. Scala grafica, 120 micron. (B) Esempio di un monostrato CFBE compromessa. Anche se il monostrato non mostra evidenti segni visibili di danni ancora, P. aeruginosa batteri sono visti diffondendo tra le giunzioni strette delle cellule epiteliali e guadagnando l'accesso alle membrane basolaterale. Formazione di biofilm non è in genere raggiunto in queste condizioni a causa del deterioramento monostrato. Scala grafica, 20 micron. (C) Esempio di un invaso P. biofilm aeruginosa osservato 24 ore dopo l'inoculazione. Dopo il successo sostenendo la formazione di biofilm, il monostrato CFBE è stato danneggiato in modo irreparabile e ora è praticamente assente. Biofilm residuo, crescendo come uno strato piatto di batteri, viene mostrato inerenti alle coprioggetto di vetro. Scala grafica, 20 micron.

Figura 2. P. biofilm aeruginosa cresciuto sulla superficie apicale delle cellule CFBE confluenti con il Co-Static cultura Modello Biofilm e la cella di flusso co-cultura Modello biofilm. (A) l'immagine di un rappresentante GFP che esprimono P. aeruginosa biofilm cresciuti su un monostrato di cellule confluenti CFBE utilizzando la statica Co-cultura Modello biofilm, valutata mediante microscopia in epifluorescenza. L'immagine è una sovrapposizione del canale di contrasto di fase e il canale di fluorescenza. Scala grafica, 35 micron. (B) l'immagine di un rappresentante GFP-etichettata P. biofilm aeruginosa coltivato per 6 ore su un monostrato di cellule confluenti CFBE utilizzando la cella di flusso co-cultura Modello biofilm. Per facilitare la visualizzazione del monostrato delle vie aeree, i nuclei sono stati colorati con 10 mcg / mL di Hoechst 33342 (Molecular Probes) per 30 minuti prima dell'inoculo con P. aeruginosa. Immagini fuse e pseudocolored sono stati visti per contrasto di interferenza differenziale (DIC), e le immagini corrispondenti fluorescenti sono mostrati. Biofilm, si presenta come grumi verde attaccato alla superficie apicale delle cellule CFBE, si disperdono attraverso le cellule delle vie aeree. Scala grafica, 20 micron. (C) tridimensionale ricostruzionezione di z-stack serie di immagini che mostrano il tipico fungo-come le strutture di 6 h-vecchio P. biofilm aeruginosa che formano un monostrato cellulare CFBE. Scala grafica, 10 micron.

I biofilm sono comunità di batteri che si formano in risposta a stimoli ambientali. Questi segnali ambientali globali portare a cambiamenti normativi all'interno di ogni batterio, con conseguente legame ad una superficie, l'aggregazione, la produzione di esopolisaccaridi, e altri fenotipi quali aumento della resistenza agli antibiotici ^10. Nel corso degli ultimi due decenni, molte prove ha sostenuto l'ipotesi che i biofilm giocano un ruolo importante nella patogenesi delle infezioni croniche. Per esempio, è ben accettato che P. aeruginosa è in grado di stabilire infezioni croniche dei polmoni di fibrosi cistica (FC) pazienti formando biofilm ^11. CF è una malattia genetica, in cui le mutazioni nel gene CFTR portare alla secrezione di cloruro improprio ^12. Pazienti con fibrosi cistica tipicamente esperienza alterato la fisiologia delle vie aeree porta a tappi di muco denso nelle vie aeree e, contemporaneamente, alle infezioni microbiche ^13. Dalla tarda adolescenza, l'agente infettivo che domina delle vie aeree CF è P. aeruginosa, che porta ad una infezione cronica biofilm che è resistente agli antibiotici ^14.

I protocolli descritti in questo documento sono state sviluppate per agire come sistema modello per studiare la formazione di biofilm sulle cellule polmonari viventi. Biofilm batterici sono implicati in molti stati di malattia e, tuttavia, sono stati studiati per lo più su superfici solide non viventi, come il vetro e la plastica ^15,16. Studiando la formazione di biofilm e la crescita su superfici abiotici solo, uno manca importanti interazioni tra ospite e patogeno che può avvenire solo con un modello di sistema come descritto nel protocollo di cui sopra. In particolare, il Co-Static cultura Modello Biofilm e la cella di flusso co-cultura Modello Biofilm sfruttare la capacità di P. aeruginosa di interagire e si legano alla superficie epiteliale del polmone. L'utilizzo di questi modelli, abbiamo dimostrato che la risposta del co-coltura biofilm al trattamento antibiotico è unico e che questi modelli hanno maggiori probabilità di rispecchiare con precisione lo stato infettivo ^1,5. A questo proposito, abbiamo riportato che la resistenza agli aumenti tobramicina da> 25 volte quando P. biofilm aeruginosa sono coltivati ​​su cellule delle vie aeree rispetto a biofilm cresciuti su superfici abiotici come il vetro ^5. E 'probabile che queste tecniche riflettono gli eventi che si verificano durante la colonizzazione primi dei ¹⁷ polmone. Pertanto, il co-coltura sistemi modello rappresentano strumenti innovativi per la comprensione infezione precoce dell'epitelio delle vie aeree CF da P. aeruginosa ^1.

Sistemi di coltura di tessuto sono state comunemente impiegato per comprendere le interazioni tra ospite e patogeno. Abbiamo preso queste interazioni un ulteriore passo avanti formando biofilm in vivo le cellule epiteliali umane. In futuro, versioni modificate dei modelli qui descritti potrebbero essere utilizzati per studiare la formazione di biofilm di batteri diversi in altri stati infettivi.