Micro-injectie van A. aegypti embryo's om transgene muggen verkrijgen

Voorbereiding van de micro-injectie

1. Bloed te voeden muggen: voor injectie van maandag tot vrijdag voeden vrouwen op de vorige donderdag.
2. Bereid glas naalden met behulp van het programma 3 of 2 (zie ook Materiaal).
3. Leggen buis voor de embryo's is Drosophila cultuur flacon. Natte watten in de bodem, met een natte schijf van filtreerpapier te bedekken.
4. Bereid plastic dekglas door steken dubbelzijdig tape om het ene uiteinde. Trim tape om dekglas, zodat het eindigt aan de rand van het dekglas.
5. Bereid olie voor uitdroging (zie ook Materiaal)
6. 150 ml plastic beker met een nat watje in de bodem, bedekt met een natte schijf van filtreerpapier (Whatman 80mm) om embryo's te houden na de injectie.

Opzetten van gedwongen leggen

1. Verzamel 60-10 bloed gevoed vrouwtjes met het gebruik van een afzuiger en overbrengen naar het Drosophila cultuur flacon met natte katoen en filtreerpapier.
2. Leg de muggen in insectory omstandigheden in het donker, en laat om eieren te leggen voor 1 uur en 15min.
3. Laat volwassenen vliegen in de kooi en verwijder het filter papier schijf met embryo's.
4. Om line-up eieren, doe dit dan onder ontleden scope. Met behulp van fijne tang nr. 5 of een geldboete penseel, plukken grijs tot darkish-grijs embryo's en schik in lijn op plein van 3MM Whatman papier doorweekt met water. Alle embryo's moeten in dezelfde richting, als injectie moet worden op de achterste paal. Het voorste einde van het embryo is iets breder dan de achterste. Droog het filter papier met embryo's door te drukken op droog filter papier om het (natte dingen zullen niet houden aan tape). De eieren overdracht, draai de schuif met de dubbelzijdige tape en druk voorzichtig op ten opzichte van de eieren. Het achterste einde van de eieren moeten heel dicht bij de rand van de dubbelzijdige tape.
5. Uitdrogen van de embryo ongeveer 1 minuut. bij kamertemperatuur. Ze beginnen te licht kuiltje als ze droog.
6. Bedek gedroogde embryo's met halogene olie om verdere uitdroging te voorkomen.

Micro-injectie van de embryo's

1. Het belangrijkste aspect van een goede injectie is de kwaliteit van de naald (zie Materials).
2. Vul een naald met de DNA-oplossing te worden geïnjecteerd met behulp van een microloader. Zeer weinig injectie oplossing is nodig: 1 tot 2 pi.
3. Sluit de naald naar de Transjector, die de injectie tijd (Manu) en druk (600) regelt, en de tegendruk (250). Micro-injectie wordt uitgevoerd met behulp van een microscoop met een bewegend podium (Leica) op 10 x vergroting en micromanipulator. Indien nodig kan een verhoogd microscoop stadium voor te bereiden door het stapelen 4-5 microscoop dia's. Plaats het deksel slip dragen van de embryo's op verhoogd podium. Horizontaal injecteren embryo's om te voorkomen dat het scheuren van de endochorion; penetratie moet op de achterste paal. Voor injectie, ik houd de naald stil en verplaats het stadium van de microscoop.
4. Injecteer 0,2-0,5 nl van de oplossing, overeenkomend met circa 1-5% van het embryo volume. Regel het injectievolume door het aanpassen van de injectie druk en tijd. De licht gebogen, uitgedroogd embryo's moeten weer hun gezwollen uiterlijk na de injectie.
5. Kies embryo's van de dekking slip met fijne pincet of een fijn penseel, en leg ze in een plastic beker met natte katoen en nat filtreerpapier. Bedek bekerglas met tissue papier. Zijn plaats te houden met elastische band rond de velg en terug te keren naar insectary voorwaarden voor 4 dagen.

Post-injectie

1. Vier dagen na, plaatst u voorzichtig embryo papier, embryo-kant naar beneden, op het water in grote plastic doos met een kleine hoeveelheid voedsel. Embryo's luik over een zeer lange periode: niet weg te gooien van de cultuur tot ten minste 4-5 weken na de injectie.

Opmerkingen

DNA voor injectie

Plasmide DNA-oplossing voor injectie werd geïsoleerd met behulp van EndoFree plasmide kit. Construct en Helper plasmide Meng in de juiste concentratie, neergeslagen met izopropanol. De pellet werd gewassen met 70% ethanol voor resuspenderen in injectie buffer. Vóór injectie schoon met behulp van DNA Millex-GV kolom.