The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
Unable to load video. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
An unexpected error occurred. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
Das, S., Garver, L., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopoulos, G. Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e220, doi:10.3791/220 (2007).
الغرض من هذا الاجراء هو لإصابة البعوضة الزاعجة مع فيروس حمى الضنك في حالة المختبرات وفحص مستوى العدوى وديناميكية من الفيروس في أنسجة البعوض. ويستخدم هذا البروتوكول بشكل روتيني لدراسة التفاعلات البعوض الفيروس ، وخاصة لتحديد العوامل المضيفة الرواية التي تكون قادرة على تحديد اختصاص النواقل. يجب أن تجرى التجربة في مختبر كامل BSL2. مماثلة للعدوى الملاريا المنجلية ، يجب أن تلبس الملابس المناسبة بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات. بعد التجربة ، وجميع المواد التي جاءت في اتصال مع الفيروس يجب أن يتم التعامل مع 75 ٪ من الإيثانول والمقشور قبل الشروع في غسل طبيعية. جميع المواد الأخرى يجب أن يتم تعقيمها قبل التخلص منها.
الخلايا تنمو إلى 80 ٪ في 75 قارورة confluency 2 سم ؛
إزالة وسائل الاعلام مع مل 3-4 المتبقية في قارورة ؛
تأخذ 0.5 مل الفيروس الأسهم وإضافة إلى الخلية المذكورة أعلاه مع تعدد العدوى من جزيئات الفيروس بنسبة 1.5 في الخلية. هز القارورة ببطء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
احتضان لمدة 45 دقيقة في 5 ٪ CO 2 و 37 درجة مئوية
إضافة الوسائط 30 مل ، واحتضان لمدة 5 أيام.
باء تحضير خليط من الفيروسات والدم
فصل الخلية مع مكشطة ونقل الخلايا وسائل الإعلام للأنابيب مخروطية 50 مل ؛
نباذة في 800G لمدة 10 دقيقة ، جمع طاف ، ولكن ترك 1ml من طاف مع بيليه الخلية ؛
تجميد أعلاه بيليه في الخلية الجافة CO 2 ثم الذوبان في الماء 37 درجة مئوية حمام ، كرر مرتين إلى ثلاث مرات ؛
نباذة في 800G لمدة 10 دقيقة ، واتخاذ طاف ، ويتحد مع طاف جمعها من الخطوة 3 ؛
جمع الدم البشري كله مع نفس الإجراء (الخطوة 3) لإعداد ثقافة العرسية تصيب الأنوفيلة البعوض مع المنجلية ؛
الجمع بين كمية متساوية من الدم البشري كله أعلاه طاف مع الفيروس من الخطوة 4 ، وإضافة مصل الإنسان (10 ٪ من حجم كاملة).
احتضان الخليط أعلاه من الدم البشري وفيروس حمى الضنك لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 ° C
جيم تغذية البعوض
هذا الإجراء هو مطابق تقريبا الى ما تم وصفها في المقطع للعدوى الملاريا المنجلية في البعوض. نحن مقايسة العدوى المعى المتوسط في يوم 7 وإصابة اللعابية في اليوم 14 بعد تغذية الدم. يتم التعامل مع جميع المواد التي جاءت في اتصال مع أول فيروس الايثانول مع 75 ٪ ثم 10 ٪ مع التبييض.
د. عيار الفحص للفيروس في الأنسجة البعوض
يومين أو ثلاثة أيام قبل تشريح الأنسجة البعوض ، وتنمو C6/36 خلية في 24 لوحة جيدا ان هذه الخلية إلى 80 ٪ في اليوم confluency عندما أجرى الفحص ؛
البعوض هي تخدير عند 4 درجات مئوية ، وظهرت التضحية العقيمة التي نقع عليها في الايثانول 75 ٪ لمدة 1 دقيقة. ثم تم غسلها بالماء المعقم البعوض مرتين قبل تشريح الغدة اللعابية المعي المتوسط أو تشريح تحت المجهر. من هذه الخطوة ، كل الإجراء أدناه يجب أن تتم في بيئة معقمة مثل خزانة السلامة البيولوجية. يتم نقل هذه الأنسجة التي تحتوي على أنبوب 150 ميكرولتر وسائل الاعلام والمتجانس مع محرك Kontes مدقة بيليه لمدة 90 ثانية ؛
جعل التخفيف 1:100 بإضافة 10 ميكرولتر من جناسة في وسائل الاعلام ميكرولتر 990 ؛
كذلك جعل 1 : 10 ، 1:100 و 1:1000 التخفيف مع المتوسط في 96 لوحة جيدا ؛
إزالة وسائل الإعلام في لوحة 24 أيضا ، وإضافة 100 ميكرولتر من كل من التخفيفات الأربعة المذكورة أعلاه على كل جانب المقابلة ؛
هزة لوحة ببطء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتضان لمدة 45 دقيقة في 5 ٪ CO 2 و 37 درجة مئوية ؛
إضافة 1ml من تراكب methycellulose (1 ٪) على كل جانب ؛
احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5 ٪ لمدة 5 أيام ؛
الخطوات من هنا لا تتطلب بيئة معقمة ولكن ينبغي أن تؤخذ كما هو الحال مع أي رعاية الممرضة الأخرى في جميع الأوقات. تجاهل تراكب methycellulose من كل لوحة وصمة عار لازالة الزائدة وسائل الإعلام
إضافة 1ml من الميثانول / الأسيتون تثبيتي (1:1) على كل بئر. تبقي على 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة ؛
تخلصي من تثبيتي ، ويغسل مرة واحدة مع 1X PBS ؛
جعل 1:1000 التخفيف إلى الأجسام المضادة ضد الفيروس الأولية مع blotto 5 ٪ ؛
إضافة 200 ميكرولتر من السائل المخفف لكل مفرط المناعة C جيدا ، واحتضان على 37 درجة لمدة 1 ساعة ؛
إزالة السوائل ومفرط المناعة وحة يغسل مع PBS X 1
يعد التخفيف من 1:1000 المتقارن المضادة للماوس الماعز (القط KPL # 074-1806) في 5 ٪ blotto (اللبن المجفف المنزوع 5G في 100 مل من برنامج تلفزيوني X 1) ، ثم قم بإضافة 200 ميكروليتر إلى كل بئر ، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ؛
تعد الركيزة على النحو التالي : 1 إضافة قرص من 3' - Diaminobenzidine terrahydrochloride (سيغما القط # D5905) في 20 مل من برنامج تلفزيوني X 1 ، بعد حلها ، ومن ثم إضافة 8 ميكرولتر من البيروكسيداز الهيدروجين 30 ٪
إضافة 200 ميكرولتر من الركيزة أعلاه إلى كل بئر. دعونا نقف عند درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة
إزالة الركيزة ووقف رد الفعل بإضافة 1ml من الماء المقطر إلى كل بئر
Do you normally culture your Ae. albopictus (C6/36) cells at 37C? Conventionally we culture at around 28C; what is the reason for keeping yours so warm?
You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.
Hi Kelly
I'm from the Dimopoulos Lab - we actually keep the C6/36 cells at 32 C, not 37 C (that was probably a typo). We have found that they grow fine at lower temperatures (27 C), but we have been getting weird results with plaque assays done at that temperature, so it may affect how the virus replicates in them.
You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.
I watched with interest your demo. The one step I was waiting to see is missing! You do not show in your video how exactly you remove the methylcellulose overlay and blot excess medium before adding the fixative.
You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.
Hi, I have a suggestion. After you kill the mosquitoes with 70% ethanol, picking them up individually with forceps to wash them looks a bit tedious. How about putting them in a cell strainer so you can pick up and wash a bunch together?
Do you normally culture your Ae. albopictus (C6/36) cells at 37C? Conventionally we culture at around 28C; what is the reason for keeping yours so warm?
1
ReplyPosted by: Kelly DusinberreMay 15, 2008, 2:06 PM