Протокол денге инфекций в Комары (A. aegypti) и определение инфекции Фенотип

Das, S., Garver, L., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopoulos, G. Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e220, doi:10.3791/220 (2007).

А. Распространить вирус в C6/36 клеточной линии.

1. Клетки растут на 80% слияния в 75 см ² колбы;
2. Удалить средах с 3-4 мл, оставшихся в колбу;
3. Возьмите 0,5 мл фондовом вирусов и добавить в выше ячейки с множественностью заражения 1,5 вирусных частиц в клетку. Встряхивания колбы в течение 15 минут медленно при комнатной температуре.
4. Инкубировать 45 минут при 5% СО ₂ и 37 ° C
5. Добавить 30 мл средствах массовой информации, и выдержать в течение 5 дней.

Б. Подготовка смеси вируса и крови

1. Отсоедините ячейки с скребок и передачи ячейки и СМИ 50 мл конические пробирки;
2. Центрифугата на 800 г в течение 10 минут; собирают супернатант, но оставить 1 мл надосадочной с осадок клеток;
3. Стоп выше осадок клеток в сухом CO _2, а затем оттепель в 37 ° С водяной бане, повторить два-три раза;
4. Центрифугата на 800 г в течение 10 минут, принимать супернатант, и в сочетании с надосадочной собранных с шага 3;
5. Сбор цельной человеческой крови с той же процедурой (шаг 3) для подготовки гаметоцит культуры инфицировать малярийных комаров с Plasmodium тропической;
6. Смешайте равное количество выше цельной человеческой крови с вирусом супернатант с шага 4, а также добавить сыворотке крови человека (10% от всего объема).
7. Инкубируйте выше смесь крови человека и вируса денге в течение 30 минут при 37 ° С водяной бане

Комаров С. Кормление

Эта процедура почти идентична той, что были описаны в разделе Plasmodium инфекций в тропической комаров. Мы анализа кишки инфекции на 7 день, и слюнных инфекции на 14 день после того, питающимися кровью. Все материалы, которые были в контакте с вирусом рассматриваются сначала с 75% этанола, а затем с 10% гипохлоритом натрия.

Д. Анализ титра вируса в тканях комара

1. Два или три дня до рассечения тканей комара, растут C6/36 ячейки в 24-луночный планшет так, что клетка достигает 80% слияния в день, когда анализ проводится;
2. Комары анестезии при 4 ° С, жертвы и всплыли стерильной путем замачивания их в 75% этаноле в течение 1 минуты. Затем комаров промывали стерильной водой дважды, прежде чем рассечения кишки или слюнных желез при вскрытии микроскопом. С этого шага все ниже процедуру необходимо проводить в стерильных условиях, таких как биологические кабинета безопасности. Эти ткани переданы пробирку, содержащую 150 мкл СМИ и гомогенизировали с Kontes гранул пестиком двигателя в течение 90 секунд;
3. Сделать 1:100 разбавления путем добавления 10 мкл гомогената в 990 мкл средствах массовой информации;
4. Сделайте еще 1: 10, 1:100 и 1:1000 разбавления среды в 96 ячейках;
5. Удалить средств массовой информации в 24-луночный планшет, и добавьте 100 мкл каждого из этих четырех разведениях к каждому из которых соответствует хорошо;
6. Встряхните пластины медленно в течение 15 минут при комнатной температуре, затем инкубировать 45 минут при 5% СО ₂ и 37 ° С;
7. Добавить 1 мл methycellulose наложения (1%) в каждую лунку;
8. Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 5 дней;
9. Шагах отсюда на не требующие стерильных условиях, а как с любой другой возбудитель следует проявлять осторожность во все времена. Отменить methycellulose наложения друг от пластины и промокните, чтобы удалить излишки средства массовой информации
10. Добавить 1 мл метанола / ацетон фиксатором (1:1) в каждую лунку. Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 ч;
11. Вылейте фиксатора, и мыть один раз 1X PBS;
12. Сделать 1:1000 разбавления до первичного антитела против вируса с 5% пьяный;
13. Добавьте 200 мкл разведенной гипериммунных жидкости в каждую лунку, инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 ч;
14. Удалить гипериммунных жидкость и промыть пластины с 1 х PBS
15. Подготовка 1:1000 разбавления антимышиного сопряжены (КПЛ Cat # 074-1806) в 5% одурманенный (5 г порошкообразного обезжиренное молоко в 100 мл 1 х PBS), а затем добавить 200 мкл в каждую лунку и инкубировать в 37 ° С в течение 1 ч;
16. Подготовка субстрата следующим образом: добавить по 1 таблетке 3 'диаминобензидина terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) в 20 мл 1 х PBS, после растворения, а затем добавить 8 мкл 30% водорода пероксидазой
17. Добавить 200 мкл выше субстрата в каждую лунку. Дайте постоять при комнатной температуре в течение 10 минут
18. Удалите подложку и остановить реакцию добавлением 1 мл дистиллированной воды в каждую лунку
19. Слейте воду и промокните пластин высохнуть
20. Граф вирусной частицы

5 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.