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Das, S., Garver, L., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopoulos, G. Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e220, doi:10.3791/220 (2007).
इस प्रक्रिया के उद्देश्य से डेंगू वायरस के साथ एक प्रयोगशाला हालत में एडीज मच्छर संक्रमित मच्छर के ऊतकों में संक्रमण और वायरस का गतिशील स्तर की जांच करने के लिए है. इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से मच्छर वायरस बातचीत उपन्यास मेजबान कारकों है कि सदिश क्षमता निर्धारित करने में सक्षम हैं की पहचान के लिए विशेष रूप से, अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है. पूरे प्रयोग एक BSL2 प्रयोगशाला में आयोजित किया जाना चाहिए. प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमण के लिए इसी प्रकार, दस्ताने और प्रयोगशाला कोट सहित उचित पोशाक हर समय पहना होना चाहिए. प्रयोग के बाद, सभी सामग्री है कि वायरस के संपर्क में आया के लिए 75% और सामान्य धोने के साथ आगे बढ़ने से पहले इथेनॉल प्रक्षालित के साथ इलाज किया जा जरूरत है. अन्य सभी सामग्री के लिए उन्हें discarding पहले autoclaved की जरूरत है.
3-4 कुप्पी में शेष मिलीलीटर के साथ मीडिया निकालें;
0.5 मिलीलीटर शेयर वायरस ले लो और सेल प्रति 1.5 वायरस कणों के संक्रमण की बहुलता के साथ ऊपर के कक्ष में जोड़. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीरे धीरे कुप्पी हिलती.
5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते
30 मिलीलीटर मीडिया जोड़ें, और 5 दिनों के लिए सेते हैं.
बी वायरस और रक्त के मिश्रण तैयार
खुरचनी के साथ सेल अलग और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों के लिए सेल और मीडिया हस्तांतरण;
10 मिनट के लिए 800g पर Centrifugate, सतह पर तैरनेवाला जमा है, लेकिन सेल गोली के साथ सतह पर तैरनेवाला के 1ml छोड़;
सूखी सीओ 2 में ऊपर सेल गोली रुक और फिर 37 डिग्री सेल्सियस जल स्नान, दोहराने दो से तीन बार में गल;
10 मिनट के लिए 800g पर Centrifugate, सतह पर तैरनेवाला ले, और चरण 3 से एकत्र की सतह पर तैरनेवाला के साथ गठबंधन;
प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के साथ एनोफ़ेलीज़ मच्छर संक्रमित gametocyte संस्कृति की तैयारी के लिए एक ही प्रक्रिया (कदम 3) के साथ पूरे मानव रक्त ले लीजिए;
ऊपर चरण 4 से वायरस सतह पर तैरनेवाला के साथ पूरे मानव रक्त के बराबर राशि का मिश्रण है, और मानव सीरम जोड़ने (पूरी मात्रा का 10%).
37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर 30 मिनट के लिए मानव रक्त और डेंगू वायरस के ऊपर मिश्रण सेते
सी. दूध पिलाने मच्छरों
यह प्रक्रिया लगभग मच्छरों में प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमण के लिए अनुभाग में वर्णित किया गया है समान है . 7 दिन में हम midgut संक्रमण परख, और रक्त भोजन के बाद 14 दिन में लार संक्रमण. सभी सामग्री है कि वायरस के संपर्क में आया था पहले तो 75% इथेनॉल के साथ और 10% ब्लीच के साथ व्यवहार कर रहे हैं.
डी. मच्छर के ऊतकों में वायरस टिटर परख
मच्छर ऊतक के विच्छेदन के पहले दो या तीन दिनों एक 24 अच्छी तरह से ऐसी है कि सेल दिन जब परख आयोजित किया जाता है पर 80 confluency% तक पहुंचने की थाली में C6/36 सेल बढ़ने;
मच्छरों 4 में anesthetized हैं डिग्री सेल्सियस, बलिदान और 75% इथेनॉल में उन्हें 1 मिनट के लिए भिगोने द्वारा बाँझ सामने. फिर मच्छरों बाँझ पानी से धोया गया midgut या लार ग्रंथि के विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत विच्छेदन से पहले दो बार. इस कदम से सभी नीचे प्रक्रिया के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के रूप में एक बाँझ वातावरण में आयोजित होने की जरूरत है. इन ऊतकों 150 μl मीडिया युक्त ट्यूब स्थानांतरित कर रहे हैं और एक Kontes 90 सेकंड के लिए गोली मूसल मोटर साथ homogenized हैं;
Homogenate के 990 μl मीडिया में 10 μl जोड़कर 1:100 कमजोर पड़ने बनाओ;
आगे एक बनाओ: 10, 1:100 और 96 अच्छी तरह से थाली में मध्यम के साथ 1:1000 कमजोर पड़ने;
24 अच्छी तरह से थाली में मीडिया निकालें, और प्रत्येक इसी अच्छी तरह से ऊपर चार dilutions के प्रत्येक के 100 μl जोड़ने;
थाली कमरे के तापमान पर 15 मिनट, तो 5% से कम 45 मिनट के लिए सेते के लिए धीरे - धीरे हिलाएँ सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस ;
एक अच्छी तरह से methycellulose उपरिशायी (1%) के 1ml जोड़ें;
37 में प्लेटें सेते ° सी 5 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ ;
यहाँ से कदम एक बाँझ वातावरण की आवश्यकता नहीं होती, लेकिन किसी भी अन्य रोगज़नक़ देखभाल के साथ के रूप में सभी समय पर लिया जाना चाहिए. प्रत्येक थाली से methycellulose उपरिशायी त्यागें और अतिरिक्त मीडिया को हटाने के लिए दाग
प्रत्येक अच्छी तरह / मेथनॉल एसीटोन लगानेवाला (1:1) के 1ml जोड़ें. 1 घंटे के लिए 4 ° C में रखें;
बंद लगानेवाला डालो, और 1X पीबीएस के साथ एक बार धो;
मदहोश 5% के साथ वायरस के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी 1:1000 कमजोर पड़ने बनाओ;
1 घंटे के लिए प्रत्येक 37 में अच्छी तरह से, सेते ° सी पतला hyperimmune तरल पदार्थ के 200 μl जोड़ें;
1 एक्स पीबीएस के साथ hyperimmune तरल पदार्थ और धोने की थाली निकालें
5% मदहोश (1 एक्स पीबीएस के 100 मिलीलीटर में 5g पाउडर मलाई निकाला दूध) में बकरी संयुग्म विरोधी माउस के एक 1:1000 कमजोर पड़ने (KPL बिल्ली # 074-1806) तैयार है, और फिर एक अच्छी तरह से 200 μl जोड़ने, और सेते 1 घंटे के लिए 37 ° सी;
सब्सट्रेट के रूप में तैयार: 1 एक्स पीबीएस के 20 मिलीलीटर में 1 3'-Diaminobenzidine terrahydrochloride गोली (सिग्मा बिल्ली # D5905) जोड़ने के बाद भंग, और फिर 30% हाइड्रोजन peroxidase के 8 μl जोड़ने
प्रत्येक अच्छी तरह से ऊपर सब्सट्रेट के 200 μl जोड़ें. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े चलो
सब्सट्रेट निकालें और एक अच्छी तरह से आसुत जल के 1ml जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकने के
Do you normally culture your Ae. albopictus (C6/36) cells at 37C? Conventionally we culture at around 28C; what is the reason for keeping yours so warm?
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Hi Kelly
I'm from the Dimopoulos Lab - we actually keep the C6/36 cells at 32 C, not 37 C (that was probably a typo). We have found that they grow fine at lower temperatures (27 C), but we have been getting weird results with plaque assays done at that temperature, so it may affect how the virus replicates in them.
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I watched with interest your demo. The one step I was waiting to see is missing! You do not show in your video how exactly you remove the methylcellulose overlay and blot excess medium before adding the fixative.
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Hi, I have a suggestion. After you kill the mosquitoes with 70% ethanol, picking them up individually with forceps to wash them looks a bit tedious. How about putting them in a cell strainer so you can pick up and wash a bunch together?
Do you normally culture your Ae. albopictus (C6/36) cells at 37C? Conventionally we culture at around 28C; what is the reason for keeping yours so warm?
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ReplyPosted by: Kelly DusinberreMay 15, 2008, 2:06 PM