Dang Enfeksiyonlar Sivrisinekler (A. aegypti) ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi için protokol

Das, S., Garver, L., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopoulos, G. Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e220, doi:10.3791/220 (2007).

A. C6/36 hücre hattı virüs yayma.

1. Hücreler 75 cm ² balonuna confluency% 80 büyüyecek;
2. 3-4 ml cam şişe içinde kalan medya çıkarın;
3. 0.5 ml stok virüs atın ve yukarıdaki hücre içine, hücre başına 1,5 virüs partikülleri enfeksiyon çokluğu ile ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaş yavaş balonu çalkalamak.
4. % 5 CO ₂ ve 37 ° C de 45 dakika inkübe
5. 30 ml medya ekleyin ve 5 gün boyunca inkübe edin.

B. virüs ve kan karışımı hazırlayın

1. Kazıyıcı ile hücre ayırın ve 50 ml konik tüpler için hücre ve medya aktarımı;
2. 10 dakika için 800g Centrifugate; süpernatantı toplamak, ancak hücre pelet süpernatant 1 ml bırakın;
3. 37 ° C su banyosu, tekrar 2-3 kez Çözülme sonra kuru CO ₂ Yukarıdaki hücre pelletini Dondurma ve;
4. Süpernatantı almak ve 3. adımdan itibaren toplanan süpernatant ile birleştirmek, 10 dakika için 800g Centrifugate;
5. Plasmodium falciparum ile Anofel sivrisinek enfekte gametocyte kültürü hazırlanması için aynı prosedürü (adım 3) tüm insan kanı toplamak;
6. Adım 4 virüs süpernatant ile yukarıdaki bütün insan kanı eşit miktarda birleştirin ve insan serum eklemek (tüm hacminin% 10).
7. 37 ° C su banyosunda 30 dakika için, insan kanı ve Dang virüsü yukarıdaki karışımı inkübe

C. Besleme sivrisinek

Bu prosedür, sivrisinek Plasmodium falciparum enfeksiyonlar için bölümünde tarif edilmiştir ne hemen hemen aynıdır . Biz 7 gün tahlil midgut enfeksiyon, tükürük kan besleme 14 gün sonra enfeksiyon. Virüs ile temas halinde gelen tüm materyaller% 75 etanol ve% 10 çamaşır suyu ile tedavi edilir.

D. Testi sivrisinek doku virüs titresi

1. İki ya da üç gün sivrisinek doku diseksiyonu önce, hücre% 80 tahlil yapılır gün confluency ulaşmak gibi bir 24 plaka C6/36 hücre büyümesi;
2. Sivrisinekler, 4 anestezi ° C, kurban ve 1 dakika boyunca% 75 etanol onları iliklerine steril su yüzüne çıktı. Sonra sivrisinek diseksiyon mikroskobu altında midgut veya tükürük bezi diseksiyonu önce iki kez steril su ile yıkandı. Bu adım, altındaki tüm prosedürü, steril bir ortamda böyle bir biyolojik güvenlik kabini olarak yürütülmesi gerekmektedir. Bu dokular 150 ul medya içeren bir tüpe aktarılır ve 90 saniye boyunca bir Kontes pelet havaneli motor ile homojenize;
3. Homojenat 10 ul 990 ul medya ekleyerek 1:100 dilüsyon olun;
4. Daha 1: 10, 96 plaka, orta 1:100 ve 1:1000 dilüsyon;
5. 24 plaka medya çıkarın ve buna karşılık gelen her iyi yukarıdaki dört dilüsyonları her 100 ul eklemek;
6. Plaka, sonra% 5, 45 dakika boyunca inkübe oda sıcaklığında 15 dakika boyunca _yavaş yavaş sallayın CO 2 ve 37 ° C;
7. Her iyi methycellulose kaplama (1%) 1 ml ekleyin;
8. 37 ° plakaları inkübe ° C, 5 gün için% 5 _CO 2 ;
9. Burada adımları steril bir ortamda gerek yoktur, ancak her zaman başka bir patojen bakım alınmalıdır. Her plaka methycellulose bindirme atın ve aşırı ortamı çıkarmak için blot
10. Her bir kuyu için metanol / aseton fiksatif (1:1) 1 ml ekleyin. 1 saat 4 ° C'de tutun;
11. Fiksatif dökün ve 1X PBS ile bir kez yıkayın;
12. % 5 dut virüsüne karşı primer antikor 1:1000 dilüsyon olun;
13. 1 saat için her 37 inkübe, iyi ° C 200 ul seyreltilmiş hiper-immün sıvı ekleyin;
14. 1 X PBS ile hiper-immün sıvı ve yıkama plakası çıkarın
15. % 5 fitil (100 ml 1 X PBS 5g toz yağsız süt) keçi anti-fare konjuge 1:1000 dilüsyon (KPL Kedi # 074-1806) hazırlayın ve sonra her bir kuyunun 200 ul ekleyin ve inkübe 1 saat için 37 ° C;
16. Substrat aşağıdaki gibi hazırlayın: çözünmüş sonra, 1 X PBS 20 ml 1 tablet (Sigma Kedi # D5905) 3'-diaminobenzidin terrahydrochloride eklemek ve daha sonra% 30 hidrojen peroksidaz 8 ul eklemek
17. Her bir kuyunun 200 ul yukarıdaki substrat ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında bekletin.
18. Substrat çıkarın ve iyi 1ml distile su ekleyerek reaksiyonu durdurmak
19. Kuruması için su ve leke plakaları kapalı dökün
20. Virüs parçacık sayımı

5 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.