Protokoll för Dengue Infektioner i Myggor (A. aegypti) och infektion Fenotyp Fastställande

Das, S., Garver, L., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopoulos, G. Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e220, doi:10.3791/220 (2007).

A. Sprid viruset i C6/36 cellinje.

1. Celler växer till 80% confluency i 75 cm ² kolv;
2. Ta bort materialet med 3-4 ml kvar i flaskan;
3. Ta 0,5 virus ml lager och lägga in ovanstående cell med den mångfald av infektion på 1,5 viruspartiklar per cell. Skaka kolven i 15 minuter långsamt vid rumstemperatur.
4. Inkubera 45 minuter vid 5% CO ₂ och 37 ° C
5. Tillsätt 30 ml media och inkubera i 5 dagar.

B. Förbered blandning av virus och blod

1. Lossa cellen med skrapan och överföra cellen och media till 50 ml koniska rör;
2. Centrifugat vid 800 gi 10 minuter, samla in supernatanten, men lämna 1 ml av supernatanten med cellpelleten;
3. Frys ovanstående cellpelleten i torr CO ₂ och sedan tina i 37 ° C vattenbad, upprepa två till tre gånger;
4. Centrifugat vid 800 gi 10 minuter, ta supernatanten, och kombinera med supernatanten samlas in från steg 3;
5. Samla helblod med samma förfarande (steg 3) för beredning av gametocyte kultur att infektera Anopheles mygga med Plasmodium falciparum,
6. Kombinera lika mycket av ovanstående helblod med virus supernatanten från steg 4, och lägg humant serum (10% av hela volymen).
7. Inkubera ovanstående blandning av humanblod och denguefeber virus i 30 minuter vid 37 ° C vattenbad

C. Utfodring myggor

Detta förfarande är nästan identiskt med vad som har beskrivits i avsnittet för Plasmodium falciparum infektioner i myggor. Vi Analysera midgut infektion vid dag 7 och saliv infektion vid dag 14 efter blod-matning. Allt material som kom i kontakt med viruset behandlas först med 75% etanol och därefter med 10% blekmedel.

D. Analysera viruset titer i mygga vävnad

1. Två eller tre dagar innan dissekering av mygga vävnad, växer C6/36 cell i en 24 brunnar så att cellen når 80% confluency på den dag då analysen sker;
2. Myggor bedövas vid 4 ° C, offrade och ytbehandlade sterila genom att blötlägga dem i 75% etanol i 1 minut. Sedan mygg spolades med sterilt vatten två gånger innan dissekering av midgut eller salivkörtlarna under dissekera mikroskop. Från detta steg, behöver all proceduren nedan för att föras i en steril miljö som en biologisk säkerhet skåp. Dessa vävnader överförs till ett rör som innehåller 150 l media och homogeniseras med en Kontes pellets mortelstöt motor för 90 sekunder;
3. Gör en 1:100 utspädning genom att tillsätta 10 ìl av homogenatet till 990 l medier;
4. Gör ytterligare 1: 10, 1:100 och 1:1000 spädning med mediet i 96 brunnar;
5. Ta bort materialet i 24 brunnar, och tillsätt 100 l av varje av ovanstående fyra utspädning för att varje motsvarande väl;
6. Skaka plattan sakta i 15 minuter vid rumstemperatur, sedan inkubera 45 minuter vid 5% CO ₂ och 37 ° C;
7. Tillsätt 1 ml methycellulose overlay (1%) i varje brunn;
8. Inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO ₂ i 5 dagar;
9. Stegen härifrån om inte kräver en steril miljö men som med alla andra patogen försiktighet bör iakttas vid alla tillfällen. Kasta methycellulose overlay från varje tallrik och blot för att avlägsna överskott medier
10. Tillsätt 1 ml metanol / aceton fixativ (1:1) i varje brunn. Förvara vid 4 ° C under 1 timme;
11. Häll av fixativ och tvätta en gång med 1X PBS;
12. Gör 1:1000 spädning för den primära antikroppen mot viruset med 5% ASFULL;
13. Tillsätt 200 l utspädd hyperimmunserum vätska till varje brunn, inkubera vid 37 ° C under 1 timme;
14. Ta bort hyperimmunserum vätska och tvätta plattan med 1 X PBS
15. Förbered en 1:1000 spädning av get-anti-mus-konjugat (KPL Cat # 074-1806) i 5% ASFULL (5g pulver skumma mjölk i 100 ml 1 X PBS), och lägg sedan till 200 l till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 1 timme;
16. Förbered underlaget på följande sätt: tillsätt 1 tablett 3'-Diaminobenzidin terrahydrochloride (Sigma Katt # D5905) i 20 ml 1 X PBS, efter upplöst, och sedan lägga till 8 l av 30% väte peroxidas
17. Tillsätt 200 l av ovanstående substrat till varje brunn. Låt stå i rumstemperatur i 10 minuter
18. Ta bort substrat och stoppa reaktionen genom att tillsätta 1 ml destillerat vatten i varje brunn
19. Häll bort vatten och torka plattorna torka
20. Räkna viruspartikeln

5 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.