Определение сотовый номер при использовании культуры клеток Счетчик скипетр сотовый

Ongena, K., Das, C., Smith, J. L., Gil, S., Johnston, G. Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter. J. Vis. Exp. (45), e2204, doi:10.3791/2204 (2010).

Подсчет клеток часто необходимо, но утомительный шаг в культуре клеток лабораторных условиях. В соответствии концентрации клетка обеспечения экспериментальной воспроизводимости и точности. Клеток очень важны для мониторинга здоровья клеток и скорость пролиферации, оценки увековечение или преобразования, посев клеток для последующих экспериментов, трансфекции или инфекции, и подготовка к клеточной анализов. Важно, чтобы количество клеток быть точной, последовательной и быстро, в частности для количественных измерений клеточных ответов.

Несмотря на это необходимо для обеспечения скорости и точности подсчета клеток, 71% опрошенных 400 исследователей, которые считают ¹ клеток с использованием гемоцитометра. Хотя hemocytometry стоит недорого, это трудоемкий и с учетом смещения пользователя и неправильного использования, что приводит к неточным рассчитывает. Hemocytometers изготовлены из специального оптического стекла, на котором клеточные суспензии, которые загружаются в указанных объемах и подсчитывали под микроскопом. Источники ошибок в hemocytometry относятся: неравномерное распределение ячейку в образце, слишком много или слишком мало клеток в образце, субъективных решений, является ли данная ячейка находится в пределах определен подсчета области, загрязнение гемоцитометра, пользователь-пользователь изменения , и изменение гемоцитометра скорость наполнения ^2.

Чтобы облегчить скуку, связанных с ручным подсчетом, 29% исследователей подсчет клеток с использованием автоматизированного подсчета клеток устройств, сюда относятся видения основе счетчиков, системы, которые обнаруживают клетки, используя принцип Coulter, или проточной цитометрии ^1. Для большинства исследователей, основным препятствием к использованию автоматизированной системы цен, связанных с этими большими настольный документами ^1.

Счетчик скипетр ячейка автоматизированных портативное устройство, которое предлагает автоматизации и точности подсчета Coulter при относительно низкой стоимости. Система использует принцип Coulter импеданса основе регистрации частиц ³ в миниатюрном формате, используя сочетание аналогового и цифрового оборудования для измерения, обработки сигналов, хранения данных и графическим дисплеем. Одноразовые наконечник спроектирован с microfabricated, клеточно-зону обнаружения, которая позволяет дискриминацию по размеру клеток и их объем на суб-микронных и суб-пиколитра разрешения. Расширенный с точностью обработки жидких каналов и электроники, счетчик скипетр ячейки отчеты клеточной популяции статистику графически отображаются в виде гистограммы.

1. Важность подсчета клеток

1. Подсчет клеток необходимы, но утомительный шаг в культуре клеток лабораторных условиях.
2. В соответствии концентрации клетка обеспечения экспериментальной воспроизводимости и точности.
3. Клеток очень важны для мониторинга здоровья клеток и скорость пролиферации, оценки увековечение или преобразования, посев клеток для последующих экспериментов, трансфекции или инфекции, и подготовка к клеточной анализов.
4. Несмотря на потребность в скорости и точности подсчета клеток, 71% из 400 опрошенных исследователями подсчет клеток с использованием гемоцитометра. Хотя hemocytometry стоит недорого, это трудоемкий и с учетом смещения пользователя и неправильного использования, что приводит к неточным рассчитывает.
5. Источники ошибок в hemocytometry относятся: неравномерное распределение ячейку в образце, слишком много или слишком мало клеток в образце, субъективных решений, является ли данная ячейка находится в пределах определен подсчета области, загрязнение гемоцитометра, пользователь-пользователь изменения , и изменение гемоцитометра скорость наполнения.
6. Чтобы облегчить скуку, связанных с ручным подсчетом, 29% исследователей подсчет клеток с использованием автоматизированного подсчета клеток устройств. Однако для большинства исследователей, цена, связанные с этими большими настольный инструментов препятствием для их использования.
7. Счетчик скипетр ячейка автоматизированных портативное устройство, которое предлагает автоматизации и точности подсчета Coulter при относительно низкой стоимости.
8. Система использует принцип Coulter импеданса основе регистрации частиц в миниатюрном формате, используя сочетание аналогового и цифрового оборудования для измерения, обработки сигналов, хранения данных и графическим дисплеем.
9. Одноразовый датчик спроектирован с microfabricated, клеточно-зону обнаружения, которая позволяет дискриминацию по размеру клеток и их объем на суб-микронных и суб-пиколитра разрешения.
10. Расширенный с точностью обработки жидких каналов и электроники, счетчик скипетр клетка графически отображает статистику клеточной популяции в виде гистограммы.

2. Подготовка одной клеточной суспензии для подсчета

1. Чтобы использовать счетчик скипетр клетке, начинают путем разбавления суспензии отдельных клеток, клеток, в фосфатным буферным раствором. Концентрация 10,000-500,000 клеток на мл является оптимальным.
2. Передача 100 мкл разбавленного клетки 1,5 трубки микроцентрифужную мл.

3. Выполнение клеток использованием скипетр

1. Включите счетчик ячейки скипетр, нажав и удерживая переключатель на задней панели прибора и ждать инструкциям на экране появится.
2. В ответ на запрос, прикрепите датчик к концу скипетра блок с электродами зондирования панель была обращена к передней части прибора.
3. Скипетр датчики состоят из литой точность выборки камера, с электронным зоны зондирования и интегрированные ячейки зондирования электродами. Датчики позволяют различать размер ячейки на суб-микронного разрешения и объема клеток на суб-пиколитра разрешения.
4. В соответствии инженерных датчика гарантирует, что равные объемы образца подсчитываются и точные измерения размера сделаны.
5. Как только датчик подключен, выполнить каждый шаг процесса подсчета согласно инструкциям на экране следующим образом:
6. Когда на экране гласит: "Удерживая поршень, чтобы начать", нажмите поршень. Экран будет читать "погрузить датчик". Погрузите датчик в раствор суспензии клеток и отпустите поршень для аспирации клеточной суспензии в датчик.
7. Поршень действует как электрический сигнал и будет опираться образца плюс мертвый объем в датчик. Скорость и точность погружения не имеет значения, как это происходит с пипеткой. Этот процесс займет несколько секунд. Когда все будет готово, прибор подаст звуковой сигнал, и "Sample загружен" будет отображаться на экране.
8. Как только образец загружается в датчик она проходит через зону обнаружения для оценки размеров клеток и их объема, то через микроканалов. После 50 мкл образца считается датчик сообщает инструмент, чтобы остановить подсчета.
9. После отсчета завершения экране прибора будет читать "Граф Complete. Удалите датчик и выбросить". Следуйте строки, а также удалить датчик.
10. Прибор будет отображать гистограмму размера ячейки и диаметра на экране, а также концентрации клеток на мл.

4. Анализ данных

1. После отсчета, является полной и гистограмма отображается на инструмент, применяется ворота, нажав переключатель. Выберите "авто стробирования" или "использование последнего" либо автоматически установить ворота на основе гистограммы профиль, или использовать ворота от предыдущего кол-ва.
2. Независимо от выбора, ворота можно вручную переместить на тонкой настройки данных. Нажмите на переключатель еще раз для выбора левого ворота и прокрутки, чтобыggle двигаться ворот по желанию.
3. Затем нажмите переключатель еще раз для включения права ворота и прокрутки переключения на место правой ворот. Нажмите кнопку еще раз; новые концентрации клеток, средний объем клетки и диаметр будут отображаться.
4. Переключение может быть перемещена в любую сторону, чтобы переключить дисплей между датой, временем, средний размер ячейки, и средний объем клеток.
5. До 72 гистограммы могут быть сохранены на сам инструмент. Для загрузки данных в персональный компьютер, приложите прибор через порт USB кабель на экране дисплея.
6. На компьютере, дважды щелкните на Прикладное программное обеспечение скипетр, чтобы запустить программу нажмите кнопку "подключиться". Все считается автоматически порт к программному обеспечению.
7. Программное обеспечение скипетр приложение отображает гистограмму подробно распределение населения по культуре в любом объеме или диаметра. Скачанные файлы могут быть экспортированы в Microsoft Excel, где исходные данные будут отображаться в бункерах указанных диаметров ячейку или томов.

5. Представитель Результаты

1. Девятнадцать различных клеточных линий были подготовлены для подсчета и теоретические начала концентрации определяется с помощью счетчика Coulter. Эти клеточные суспензии, затем разбавить для получения клеточных суспензий на теоретических концентрации клеток.
2. Счетчик скипетр ячейка затем используется для определения концентрации клетка. На рисунке 1 показаны 5 разведения, которые были измерены в течение 5 представителем клеточных линий наряду с теоретической концентрации клеток.
3. Высокой линейности, как указано R2 ценностей, показывает, что скипетр подсчета надежный метод клеточных линий испытания, через широкий линейный диапазон.
4. Общей относительной точностью скипетр подсчета показано на рисунке 2, в которой данные, полученные из подсчета скипетр сравниваются с рассчитывает получить из подсчета Коултер.
5. Журнал считает скипетр ячейка заговор против журнала насчитывает Coulter, и показывает, что, по всем клеточных линий испытания, скипетр рассчитывает матча Coulter рассчитывает.
6. Графы 19 клеточные линии были проведены с использованием Z2 Coulter Counter, счетчик скипетр клетки, автоматизированных видение основе счетчика, таких как Vi-Cell или Бесчисленные системы, и hemocytemeter.
7. Графы были выполнены в соответствии с инструкциями производителя, используя те же ячейки, начиная подвески и одинаковые разведений. Результаты, показанные на рисунке 3, показывают, что клетка концентрации измеряется скипетр подсчета точно соответствовать теоретической концентрации клетка с высокой линейности.
8. Процентов коэффициент вариации, или CV, была рассчитана для каждого разведения каждой клеточной линии для каждой системы подсчета. Рисунок 4 показывает среднее резюме% по сравнению с 19 клеточных линий по концентрации клеток и метод подсчета.
9. В рабочем диапазоне, счетчик скипетр ячейка более точным, чем видение, основанное подсчета гемоцитометра, отображения небольших стандартных отклонений и меньшие средние коэффициенты вариации.
10. Скипетр подсчета в десять раз быстрее, чем hemocytometry и быстрее, чем другие автоматические счетчики тоже. В рис. 5, SF9, MCF7, и HEK293 насчитывалось используя методы, описанные в этом видео.
11. Среднее время, необходимое для измерения концентрации клеток был записан. Обратите внимание, что hemocytometry был выполнен только один раз за образец.
12. Скипетр делает измерений на основе размера ячейки. Таким образом, любые изменения в клеточной морфологии могут быть захвачены в гистограмме. Здоровый культур дисплей хорошо колоколообразной гауссовского распределения, в то время нездоровых клеток, лизировать, и вызывают сдвиг гистограммы влево (рис. 6, слева).
13. Аналогичным образом, когда население 50% мертвых клеток были смешаны с 50% живых клеток, гистограмма сдвиги наблюдались (рис. 6, справа).

Сравнение производительности счетчик ячейки скипетр с результатами других методов подсчета, приходим к выводу, что этот новый портативный, автоматизированные счетчик клетка обеспечивает точный, быстрый и надежный телец в широком диапазоне. Функциональность скипетр подсчета является результатом точных инженерных технологий встроена в наконечник датчика и сложные приборы подсчета основанного на принципе Коултер. Качества работы предполагает скипетр учета, как метод для увеличения скорости и повышения воспроизводимости клеточных анализов. Карманный формат позволяет быстро скуки свободного подсчета прямо на капот культуре клеток.

Кэтлин Ongena, Chandreyee Дас, Джанет Л. Смит, Соня Гиль, и Грэйс Джонстон работает на Millipore, которая производит инструменты, используемые в этой статье.

1. Barghshoon, S. Cell Counting Survey. Millipore (2009).
2. Tucker, K.G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C.R. Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis. Enzyme Microb Technol 16 (1), 29-35 (1994).
3. Houwen, B. Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. Medical Laboratory Observer (2003).

5 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.