Determinar el número de células durante el cultivo celular utilizando el contador de células Cetro

Ongena, K., Das, C., Smith, J. L., Gil, S., Johnston, G. Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter. J. Vis. Exp. (45), e2204, doi:10.3791/2204 (2010).

El recuento de células es a menudo un paso necesario, pero tedioso para cultivo celular in vitro. Concentraciones consistentes celular asegurar la reproducibilidad experimental y precisión. Los recuentos de células son importantes para la vigilancia de la salud celular y la tasa de proliferación, la evaluación de la inmortalización y transformación, la siembra de células de experimentos posteriores, transfección o infección, y la preparación de ensayos basados ​​en células. Es importante que el recuento de células se precisa, coherente y rápida, en particular para la medición cuantitativa de la respuesta celular.

A pesar de esta necesidad de la velocidad y la precisión en el recuento de células, el 71% de los 400 investigadores encuestaron a ^una que cuentan las células utilizando un hemocitómetro. Mientras hemocytometry es barato, es laborioso y sujeto a un sesgo de usuario y el uso indebido, que se traduce en cuenta inexacta. Hemocytometers están hechas de vidrio óptico especial en el que las suspensiones celulares se cargan en los volúmenes especificados y contados bajo un microscopio. Fuentes de errores en hemocytometry incluyen: la distribución desigual de células en la muestra, de más o de muy pocas células en la muestra, las decisiones subjetivas en cuanto a si una célula dada entra en el área de conteo definido, la contaminación del hemocitómetro, de usuario a usuario variación , y la variación de la tasa de llenado de ² hemocitómetro.

Para aliviar el tedio asociado con el conteo manual, el 29% de los investigadores cuentan con las células de células automatizado contar los dispositivos, que incluyen la visión basada en los contadores, sistemas que detectan las células utilizando el principio de Coulter, o citometría de flujo ^1. Para la mayoría de los investigadores, la principal barrera a la utilización de un sistema automatizado es el precio asociado con estos grandes instrumentos de sobremesa ^1.

El contador de células cetro es un dispositivo automático de mano que ofrece la automatización y la exactitud del conteo Coulter, a un costo relativamente bajo. El sistema utiliza el principio de la detección de partículas Coulter impedancia basada en ^tres en un formato de miniatura utilizando una combinación de hardware analógico y digital para la detección, procesamiento de señales, almacenamiento de datos y visualización gráfica. La punta desechable se ha diseñado con un microfabricated, células de detección de la zona que permite la discriminación por tamaño de la celda y el volumen celular a nivel sub-micrones y la resolución de sub-picolitros. Mejorado con una precisión de manejo de líquidos de los canales y la electrónica, el contador de células Cetro informes de estadísticas de la población de células muestran gráficamente en forma de histograma.

1. La importancia de contar con celular

1. Contando las células es un paso necesario pero aburrido para el cultivo celular in vitro.
2. Concentraciones consistentes celular asegurar la reproducibilidad experimental y precisión.
3. Los recuentos de células son importantes para la vigilancia de la salud celular y la tasa de proliferación, la evaluación de la inmortalización y transformación, la siembra de células de experimentos posteriores, transfección o infección, y la preparación de ensayos basados ​​en células.
4. A pesar de la necesidad de velocidad y la precisión en el recuento de células, el 71% de los investigadores encuestaron a 400 células cuentan con un hemocitómetro. Mientras hemocytometry es barato, es laborioso y sujeto a un sesgo de usuario y el uso indebido, que se traduce en cuenta inexacta.
5. Fuentes de error en hemocytometry incluyen: la distribución desigual de células en la muestra, de más o de muy pocas células en la muestra, las decisiones subjetivas en cuanto a si una célula dada entra en el área de conteo definido, la contaminación del hemocitómetro, de usuario a usuario variación , y la variación de la tasa de llenado hemocitómetro.
6. Para aliviar el tedio asociado con el conteo manual, el 29% de los investigadores cuentan las células se utilizan dispositivos automáticos conteo de células. Sin embargo, para la mayoría de los investigadores, el precio asociado con estos grandes de banco de instrumentos es una barrera para su uso.
7. El contador de células cetro es un dispositivo automático de mano que ofrece la automatización y la exactitud del conteo Coulter, a un costo relativamente bajo.
8. El sistema utiliza el principio de la detección de partículas Coulter impedancia basada en un formato de miniatura utilizando una combinación de hardware analógico y digital para la detección, procesamiento de señales, almacenamiento de datos y visualización gráfica.
9. El sensor desechable se ha diseñado con un microfabricated, la célula de detección de la zona que permite la discriminación por tamaño de la celda y el volumen celular en el sub-micrones y la resolución de sub-picolitros.
10. Mejorado con una precisión de manejo de líquidos de los canales y la electrónica, el contador de células cetro muestra gráficamente las estadísticas de la población de células en forma de histograma.

2. Preparación de una suspensión de una sola célula para el recuento

1. Para utilizar el contador celular Scepter, empezar por la dilución de una suspensión de células individuales de las células, en tampón fosfato salino. Una concentración de 10,000-500,000 células por ml es lo óptimo.
2. Transferencia de 100 L de células diluidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

3. Realizar recuentos de células usando el cetro

1. Encienda el contador de células Cetro pulsando y manteniendo pulsado el conmutador en la parte posterior del instrumento y esperar las instrucciones en pantalla para aparecer.
2. Cuando se le solicite, conecte un sensor al final de la unidad cetro con el panel de electrodo sensor mirando hacia la parte frontal del instrumento.
3. Sensores cetro consiste en una cámara de precisión del muestreo, moldeado, con una zona de detección electrónica e integrada electrodos de detección de células. Los sensores permiten discriminar el tamaño de celda en el sub-micras de resolución, y el volumen celular en el sub-picolitros resolución.
4. Ingeniería sensor consistente, asegura que volúmenes iguales de la muestra se cuentan y las medidas exactas de tamaño se hacen.
5. Una vez que el sensor está conectado, lleve a cabo cada paso del proceso de conteo de acuerdo a las instrucciones de la pantalla de la siguiente manera:
6. Cuando la pantalla se lee "Mantenga el émbolo para empezar", el émbolo. La pantalla mostrará "sumergir el sensor." Sumerja el sensor en la solución de suspensión celular y la liberación del émbolo para aspirar la suspensión de células en el sensor.
7. El émbolo actúa como una señal eléctrica y extraer la muestra, más volumen muerto en el sensor. La velocidad y precisión de sumergirse, no importa como lo hace con la pipeta. Este proceso tardará varios segundos. Cuando esté listo, el instrumento emitirá un pitido, y "Ejemplo de carga" se mostrará en la pantalla.
8. Una vez que la muestra se carga en el sensor que se dibuja a través de la zona de detección para evaluar el tamaño celular y el volumen celular, luego a través de los microcanales. Una vez que 50 L de la muestra se cuenta el sensor indica el instrumento para detener el conteo.
9. Tras el recuento se ha completado, la pantalla del instrumento mostrará "Conteo Completo. Retire y deseche el sensor". Siga las indicaciones, y retirar y desechar el sensor.
10. El instrumento mostrará un histograma de tamaño de la celda o el diámetro de su pantalla, así como la concentración de células por ml.

4. Análisis de Datos

1. Tras el recuento se ha completado y el histograma se muestra en el instrumento, se aplican las puertas pulsando el botón de activación. Seleccione "gating auto" o "último uso" a cualquiera ajusta automáticamente la puerta en función del perfil de histograma, o para usar las puertas de la cuenta anterior.
2. Independientemente de la selección, las puertas se pueden mover manualmente para ajustar los datos. Presione el botón de alternar de nuevo para seleccionar la puerta de la izquierda y vaya a laggle para mover la puerta a su gusto.
3. A continuación, pulse la palanca de nuevo para activar la puerta de la derecha y desplazar la palanca para colocar la puerta de la derecha. Haga clic de nuevo, una nueva concentración de células, el volumen celular y el diámetro en la pantalla.
4. La palanca también se puede mover hacia los lados para cambiar la visualización entre la fecha, la hora, la media de tamaño de la celda, y el volumen celular.
5. Hasta 72 histogramas se pueden almacenar en el propio instrumento. Para cargar los datos a un ordenador personal, conecte el instrumento a través del puerto USB del cable en la pantalla.
6. En el PC, haga doble clic sobre la Aplicación de Software Cetro para iniciar el software y haga clic en "conectar". Todos los cargos de forma automática el puerto con el software.
7. El software de aplicación cetro muestra el histograma que detalla la distribución de la población de la cultura, ya sea en volumen o diámetro. Los archivos descargados pueden ser exportados a Microsoft Excel, donde los datos en bruto se mostrará en los contenedores de los diámetros de celda especificada o volúmenes de la célula.

5. Resultados representante

1. Diecinueve diferentes líneas celulares se prepararon para el recuento y la concentración de partida teórico se determinaron mediante un contador Coulter. Estas suspensiones celulares fueron luego más diluidos para obtener suspensiones celulares en las concentraciones de células teórico.
2. El contador de células cetro se utilizó para determinar las concentraciones de células. La figura 1 muestra cinco diluciones que se midieron durante 5 líneas celulares representativas, junto con la concentración de células teórico.
3. El alto grado de linealidad, como se indica en los valores R2, demuestra que el conteo de Cetro es un método confiable para las líneas celulares estudiadas, a través de un amplio rango de funcionamiento lineal.
4. La precisión global relativa de contar cetro se demuestra en la figura 2, en el que los datos obtenidos de contar cetro se comparan con los recuentos obtenidos a partir de contar Coulter.
5. El registro de los recuentos de células cetro se traza contra el registro de la cuenta Coulter, y muestra que, en todas las líneas celulares estudiadas, cuenta Cetro coincidir cuenta Coulter.
6. Cuenta de 19 líneas celulares se realizó con un Z2 Coulter Counter, el contador celular Scepter, un contador automatizado basado en visión, como Vi-celular o sistema, comercios, y un hemocytemeter.
7. Los conteos se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante, utilizando la misma célula de partida suspensión y las diluciones idénticos. Los resultados mostrados en la Figura 3 demuestran que las concentraciones de células medida por cetro contar asemejan las concentraciones teóricas de células con una alta linealidad.
8. El coeficiente de variación por ciento, o CV, se ha calculado para cada dilución de cada línea celular para cada sistema de conteo. La Figura 4 muestra el CV% promedio de más de 19 líneas de células con respecto a la concentración de células y el método de recuento.
9. Dentro del rango de funcionamiento, el contador de células cetro es más preciso que el recuento del hemocitómetro visión basada, mostrando pequeñas desviaciones estándar y pequeños coeficientes promedio de la variación.
10. Contar cetro es diez veces más rápido que hemocytometry y más rápido que otros contadores automatizados también. En la figura 5, SF9, MCF7, y las células HEK293 se contaron usando los métodos descritos en este video.
11. El tiempo medio necesario para medir la concentración de células fue grabada. Tenga en cuenta que hemocytometry se llevó a cabo una sola vez por cada muestra.
12. Cetro que hace las mediciones basadas en el tamaño celular. Así, cualquier cambio en la morfología celular puede ser capturado en el histograma. Culturas saludables presenta una distribución en forma de campana de Gauss agradable, mientras que las células enfermas, lisis, y provocar un cambio en el histograma a la izquierda (Figura 6, panel izquierdo).
13. Del mismo modo, cuando una población de células muertas el 50% se mezclaron con las células del 50% en vivo, los cambios también se observaron histograma (Figura 6, panel derecho).

Comparar el desempeño del contador de células Cetro de los resultados de otros métodos de recuento, se concluye que este nuevo contador de mano, de células automatizado proporciona el recuento de células precisa, rápida y confiable sobre un amplio rango de operación. La funcionalidad de contar Cetro es el resultado de la tecnología de ingeniería de precisión incrustado en la punta del sensor y la instrumentación de contar sofisticado basado en el principio de Coulter. La calidad del desempeño sugiere Cetro contando como método para aumentar la velocidad y mejorar la reproducibilidad de los ensayos basados ​​en células. Su formato de mano permite que el tedio rápida sin derecho a contar desde la capilla de cultivo de células.

Kathleen Ongena, Das Chandreyee, Janet L. Smith, Gil Sonia, y Johnston Gracia son empleados por Millipore, que produce los instrumentos utilizados en este artículo.

1. Barghshoon, S. Cell Counting Survey. Millipore (2009).
2. Tucker, K.G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C.R. Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis. Enzyme Microb Technol 16 (1), 29-35 (1994).
3. Houwen, B. Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. Medical Laboratory Observer (2003).

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