CryoStor Criopreservação Protocolo

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Criopreservação eficácia - o que inclui a recuperação pós-descongelamento, viabilidade e funcionalidade é importante para ambas as pesquisas e aplicações clínicas. As tensões acumuladas que resultam do processo de criopreservação e congelamento suboptimal resultado media na morte de células da necrose e apoptose. ^1-5 células e tecidos podem ser preparados e conservados em ultra ambientes de baixa temperatura (-80 ° C a -196 ° C), utilizando CryoStor criopreservação soluções. Uma vez que estas soluções são formulados para abordar os aspectos da biologia molecular de células durante o processo de criopreservação, reduzem o nível de criopreservação morte celular induzida por início tardio, melhorando assim a pós-descongelamento viabilidade celular e função. Além disso, eles precisam incluir soro, proteínas, ou altos níveis de agentes citotóxicos é eliminado com este protocolo. Neste artigo de vídeo, vamos demonstrar os procedimentos para o congelamento, armazenamento e descongelamento de células, bem como uma avaliação da viabilidade das células pós-descongelamento.

1. Células preparando para Criopreservação

1. Para se preparar para a criopreservação de células, colocar em suspensão por dissociação mecânica ou enzimática.
2. Em seguida, centrifugar células para obter um pellet de células.
3. Após a centrifugação, remover o máximo de meios de cultura sobrenadante possível, para reduzir a diluição da solução CryoStor, que será adicionado na próxima etapa.
4. Antes de abrir a garrafa de solução CryoStor frio, limpe a parte externa do recipiente com álcool 70%.
5. ISOLAMENTO: Adicionar CryoStor fria para obter concentrações de células de 0,5-10 x 10 ⁶ células / mL.
6. PRÉ-FREEZE: Incubar a suspensão de células a 2-8 ° C por aproximadamente 10 minutos.

2. Congelamento e armazenamento de células

1. Para congelar sistemas de células de mamíferos mais, use uma taxa padrão de protocolo de resfriamento lento e controlado com um dispositivo de congelamento ou recipiente isopropanol pré-resfriado a 2-8 ° C.
2. Nucleação: Congelar as amostras a -80 ° C.
3. Após aproximadamente 10 min. a -80 ° C, iniciar a nucleação de gelo dentro da amostra (semeadura) em cerca de -5 ° C usando um programa de ruptura de nitrogênio líquido configuração em um freezer taxa controlada ou agitação mecânica (filme ou toque) do recipiente cryovial / amostra.
4. Congelar as células por 3-4 horas (para container isopropanol).
5. CONSERVAÇÃO: Para armazenamento de longo prazo, as amostras lugar a temperaturas de nitrogênio líquido, abaixo de -130 ° C. Armazenamento da amostra a -80 ° C é recomendado apenas para armazenamento a curto prazo de semanas a meses.

3. Células descongelamento

1. As amostras congeladas devem ser descongeladas rapidamente em banho-maria a 37 ° C. Agite suavemente a amostra (s) até que todo o gelo derreteu visíveis. O tempo aproximado para descongelar uma amostra de 1 mL em uma cryovial é de aproximadamente 3 minutos.
2. Não permita que a amostra (s) para aquecer acima das temperaturas refrigeradas (0-10 ° C). Quando removido do banho de água, o cryovial (s) deve ser fria ao toque.
3. Diluir a mistura de células / CryoStor imediatamente com meios de cultura que está entre 20 ° C e 37 ° C, utilizando uma razão de diluição de 1:10 ou maior de amostra para a mídia.
4. Células placa na configuração apropriada.
5. Células colocar em condições de cultura ou utilizar imediatamente.
6. Vinte e quatro horas pós-descongelamento, avaliar as células para a viabilidade.

4. Resultados representativos

1. Resultados da avaliação de viabilidade celular de 24 horas pós-descongelamento são vistos na Figura 1. Comparar os resultados das células descongeladas com não-congelados controles.

Figura 1. Recuperação de fibroblastos humanos, após a criopreservação em meios de cultura tradicionais / soro / DMSO ou o soro-livre e livre de proteína intracelular CryoStor-like: normal fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) foram criopreservados em meios de cultura / soro / DMSO ou em meios de CryoStor criopreservação. Após o descongelamento, as células foram autorizados a se recuperar em condições de cultura padrão (37 ° C / 5% de ar CO ₂ / úmido) em media de crescimento de fibroblastos. As células foram analisadas em 24 horas pós-descongelamento com alamarBlue para avaliar adequadamente a viabilidade celular após a manifestação do início retardado processos de morte celular, como apoptose e necrose secundária.

Este vídeo demonstraram a eficácia de uma solução de criopreservação criopreservação intracelular-like sem soro e proteína livre em comparação com um cryococktail tradicional feita a partir de meio de cultura, soro e DMSO. Como criopreservar as células, os benefícios de usar uma solução de criopreservação intracelular-like, e um exemplo de como avaliar a viabilidade das células verdadeira pós-descongelamento foram delineadas. É importante notar que, porque as células morrem por apoptose e necrose pós-descongelamento durante um período de horas a dias, o que é observado como Percebida Viabilidade imediatamente pós-descongelamento pode não ser a verdadeira viabilidade a longo prazo. Esta morte celular de início retardado pode, posteriormente, o impacto da qualidade do enxerto de células ea recuperação eficaz de celulares capacidades funcionais, os quais são fundamentais para o sucesso do celular clínicos e terapias de tecidos.

Aby Mathew é empregado por Biolife Solutions, Inc, que produz o reagente utilizado neste artigo.

1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).

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