תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

1. הכנת כלובים לעוף

1. לגדול תסיסנית (wild-type זנים כגון אורגון-R או כל גנוטיפ) במיכלים נוח כמו 32 גרם כוסות חרקים.
2. העברת זבובים eclosed החדש לעובר איסוף כלובים גדולים או לטוס כלובים האוכלוסייה.
3. הזז את הכלובים לחדר עם טמפרטורה של ~ 25 ° C ולחות ~ 65% באור 12 שעות ו מחזור כהה 12 שעות כדי להקל על אוסף של עוברי סינכרוני.
4. שמירה על זבובים בכלובים מאכילים אותם הרג להדביק שמרים פסים על הצלחות מולסה. שנה את לוחות מולסה (עם שמרים להדביק הרוגים) פעם ביום במשך 2-3 ד

2. אוסף של עוברים סינכרוני

1. ביום ההכנה העיקרי תאים, להאכיל את הזבובים צלחות טרי wth מצופה שמרים נהרגו להדביק לתקופה 1-2 שעות, שכבה מראש.
2. רגע לפני מחזור 12 שעות בחושך, להחליף את צלחות להניח מראש עם צלחות מולסה טרי מפוספס עם כמות מינימלית של להדביק שמרים. מחק את האוסף להניח מראש, אשר מכיל יותר עוברים אסינכרוני.
3. איסוף עוברים לתקופה של 1-2 ח
4. הסר את צלחות המכילות את האוכלוסייה סינכרוני יחסית של עוברים חנות של 25 מעלות צלזיוס במשך 5-6 ח עוברים יהיה בשלב מתקדם gastrula בשלב זה.

3. איסוף כביסה של עוברים

1. שחרר את העוברים מן צלחות עם מכחול רטוב, ולשטוף היטב במי ברז פושרים דרך להגדיר מוערמים הנפות, כך העוברים לאסוף במסננת רשת הטובים ביותר בתחתית. לשטוף למשך כמה דקות כדי להסיר כמו שמרים הרבה ופסולת לטוס ככל האפשר.
2. עצה מסננות כך העוברים לצבור בצד אחד, לשטוף אותם בעדינות מן המסננת לתוך סל dechorionation.
3. מעבר אל אזור בתרבית רקמה מכסה המנוע מבלי לאפשר העוברים להתייבש.

4. Homogenization של עוברים ציפוי של תאים

1. מחטאים dechorionate את העוברים על ידי שיקוע שלהם ב -50% (כרך / כרך) מלבין 5-10 דקות. שוטפים את העוברים מהקיר סל עם 70% (כרך / כרך) אתנול. לחלופין, לשטוף באקונומיקה את העוברים עם מים מזוקקים לפני הטיפול אתנול. מנקודה זו ואילך העוברים צריכים להיות מטופלים בתנאים סטריליים ועל מכסה המנוע בתרבית רקמה.
2. שטפו ביסודיות את העוברים כדי להסיר את אקונומיקה ו / או אתנול במים מזוקקים autoclaved.
3. במהלך השלב dechorionation, למלא homogenizer Dounce עם נפח של המדיום המתאים לטמפרטורה M3 חדר מבוסס על כמות העוברים. היחס בין נפח של עוברים ושל התקשורת לא צריכה להיות על עוברי 0.5-מ"ל: 40 מ"ל התקשורת (או ~ 100-200 עוברי / ml).
4. מניחים את העוברים שטפה בכוס מעוקר עם כמות של M3 התקשורת מספיק כדי להטביע את העוברים. בואו העוברים להשרות 2-5 דקות.
5. לפרק את סל dechorionation ומוחה את רשת Nitex יבש עם מגבות נייר מעוקרים.
6. מעבירים את העוברים לתוך homogenizer עם מכחול מעוקרים.
7. Homogenize בעדינות בתנועות קצרות באמצעות העלי משוחרר בלי להגיע לתחתית של התחתית עד שכל העוברים מושעים. ואז בעדינות אך בתקיפות, homogenize עם שמונה משיכות מלא. אין לסובב את העלי כפי שהוא נע מעלה ומטה.
8. מעבירים את homogenate לתוך צינור 50 מ"ל סטרילי לצנטריפוגה חרוטי או על ידי שפיכת או pipetting, והכובע את הצינורית.
9. צנטריפוגה במשך 10 דקות על 40 גרם, בטמפרטורת החדר כדי גלולה הפסולת רקמות, תאים גושים גדולים ממברנות vitelline. מעבירים את supernatant המכיל את התאים חלמון לצינור נקי לחזור על השלב צנטריפוגה דקות 5.
10. בזהירות העברת supernatant ידי שפיכת או pipetting לתוך צינור ספין נקי במשך 10 דקות ב 360g, בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים. בטל supernatant. Resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של מדיום תרבות (סרום ללא בינוני ניסויים RNAi).
11. ספירת תאים קיימא באמצעות hemocytometer להעריך את צפיפות התאים. בינתיים, חזור על שלב 4.10 ל גלולה התאים.
12. Resuspend התאים לריכוז הרצוי. כדי להתחיל, לנסות מגוון של 1 ~ 5 x10 ⁶ תאים / מ"ל ו - צלחת החוצה 1.7-2.5 x10 ⁵ תאים / ² ס"מ.

5. Primary-RNAi התא בתאי צמח על צלחת 384, גם

1. לוותר על 5 μl של dsRNAs לבאר כל בריכוז הסופי של ng 250 ~ לכל היטב צלחת 384 היטב.
2. השתמש מרובת ערוצים פיפטה, לוותר על 10 מ"ל (1 ~ 4x106 תאים / מ"ל) של תאים ראשוניים לכל טוב בינוני M3 סרום ללא בצלחת 384-היטב המכיל dsRNA שונים גם כל אחד. לחלופין, ניתן תאים בתרבית על 8-היטב קאמרית שקופיות הזכוכית הדמיה confocal.
3. צנטריפוגה צלחות דקות 1 ב 300 גרם, בטמפרטורת החדר. התרבות התאים בינוני סרום ללא במהירות של 25 מעלות צלזיוס למשך 22 שעות או 18 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ד
4. הוסף 30 מ"ל של מדיום סרום המכיל תרבות היטב כל אחד. צנטריפוגה צלחות דקות 1 ב 300 גרם, בטמפרטורת החדר.
5. מקמי את הצלחות בתא תרבות לחים התאים העיקרי 5 ~ 7 ד נוסף של 25 ° C.
6. התאים תמונה או לחיות או הכתמה לאחר immunofluorescence.

6. נציג תוצאות:

בתנאים אופטימליים, התאים בתרבית ייראה בריא עם מורפולוגיה עגול. התרבות תהיה פסולת התא הקטן, להיות 50 ~ 80% ומחוברות לאחר ציפוי ראשוני. תאים אלה יעברו שינויים מורפולוגיים לאחר בתרבית במשך תקופה ארוכה של זמן. בדרך כלל לוקח כ 5-8 ימים התאים בתרבית כדי להיות מובחן מלא של 25 ° C. תרבויות באיכות טובה העיקרי נשפטים בדרך כלל על ידי כמה תאים של עניין הם מובחנים בתרבות. לדוגמה, לתאי השריר העיקרי לעתים קרובות יש מורפולוגיה הסניף כמו ולהיות myotubes multinucleated עם פס דמוי myofibrils המורכב מסדרה של sarcomeres. Myotubes מובחן לגמרי בדרך כלל באופן ספונטני להזיז בתרבות. לעומת זאת, הנוירונים העיקרי מובחן הטופס אשכולות עם גופי התא שלהם, להתחבר עם אשכולות אחרים עם כבלים האקסון שלהם.

באיור 1. תאים ראשוניים עוברים שינויים מורפולוגיים לאחר מצופה בתרבות
(א) התמונה בשדה בהיר של תאים ראשוניים ימין לאחר מצופה בבאר צלחת 384 היטב. רוב התאים הם עגולים שלמים מופרדים היטב. (ב) התמונה בשדה בהיר של תרבית תאים ראשונית 20 שעות לאחר ציפוי. תאים ראשוניים כבר הטופס אשכולות (חץ גדול) ואת שרירי עם מורפולוגיה ענף דמוי (חץ ארוך) ניתן לזהות בשלב זה. (ג) תמונה שלב ניגודיות של התרבות העיקרי 5 ימים לאחר ציפוי. התרבות נראה הרבה יותר מתקדם, עם סיומות עצביות (חיצים קטנים), צבירי נוירונים (ראשי חץ גדול) והשרירים (בגודל בינוני החץ).

איור 2. דוגמאות של תאים ראשוניים שטופלו dsRNAs בתרבית צלחת 384, באר
תאים ראשוניים בודדו מן העוברים נושאת Dmef2-Gal4, D42-Gal4, כטב"מ-Mito-GFP transgenes, שבו Dmef2 Gal4-D42 ו-Gal4 ביטוי הכונן של מיטו-GFP בשרירים הנוירונים המנוע, בהתאמה. התאים טופלו dsRNAs מיקוד או lacZ (AC) או מנופח (אם) (DF). שני השרירים הראשי נוירונים ניתן לראות על ידי ה-GFP (A, C, D, F). החצים הלבנים מצביעים על סיומות עצביות. מכתים Phalloidin של אקטין (ראשי חץ) מגלה מבנה הענף, כמו שריר בתרבות שטופלו lacZ dsRNAs (B ו-C), אבל מסביב את המורפולוגיה שרירים בתרבות שטופלו אם dsRNAs (E ו-F). בתמונות הממוזגת (C, F), השרירים מוכתמות צהוב, אדום אבל מראה נוירונים שלילי הרחבות שלהם (חצים לבנים).

איור 3. Micrographs Confocal של השרירים העיקריים תרבותי על האנושית vitronectin מצופה זכוכית לכסות שקופיות
השרירים העיקריות היו מוכתמים immunofluorescently עם אנטי תסיסנית Titin (KZ) (אדום במיזוג) ועם phalloidin עבור אקטין (ירוק במיזוג). לוחות העליון הם שרירים wild-type מלאה אלה התחתונה הם סאלס (CG31374) שריר RNAi עם sarcomeres מקוצר.

דפוס התפתחותי של תרבויות העיקרי של תאים תסיסנית יכול להשתנות במידה רבה, ככל הנראה בשל מספר משתנים במהלך תהליך התא הראשוני הכנה. קודם כל, זבובים המשמשים להנחת ביצה צריך להיות צעיר (בתוך שבוע הישן) ובריא (ללא זיהום נגיפי או חיידקי). עוברים מופרית או נגוע יש להימנע, שכן הם חסרי תועלת בתאים שמקורם בעוברים אלה לא ניתן להבדיל רק לשרוד במשך 1-2 ימים. שנית, במהלך תהליך homogenization, חשוב לא להעמיס homogenizer עם עוברים מדי. העמסת homogenizer עם עוברים מדי תגרום לעלייה בכמות הפסולת ועל מספר התאים המתים, אשר בסופו של דבר לפשרה התמיינות תאים. לבסוף, התאים צריכים להיות מצופה בצפיפות המתאימים כדי להבטיח בידול טוב של תאים ראשוניים. מצאנו כי הבידול של שני נוירונים ותאי שריר מצטמצם באופן דרמטי כאשר התאים העיקריים הם זורעים בתחילה צפיפות גבוהה מדי.

לניתוח פנוטיפי, צלחות 384-משמשים בדרך כלל גם לגדל תאים ראשוניים להקרנה או ניתוח הדמיה בהגדלה נמוכה. תמונות עם הגדלה הרבה יותר גבוה ורזולוציה יותר ניתן להשיג על ידי התאים גדל בשקופית מכסה זכוכית קאמרית, ואחריו הדמיה או תאים חיים או מוכתמים באמצעות מיקרוסקופ confocal. כאשר תאים ראשוניים ביותר הם חסיד, האזור עבור התאים גדל היטב של שקופיות קאמרית אמור לשמש כקו מנחה עבור הערכה של מספר שני תאים כמות בינונית נדרש גם כל אחד. בנוסף, מכסה זכוכית שקופיות קאמרית יכולים להיות מצופים תאית (ECM) חלבונים מטריצה ​​כגון vitronectin אדם, laminin קולגן IV או לאפשר התמיינות של תאים ריבית של. לדוגמה, השרירים העיקריים להבחין היטב על הזכוכית המכסה הלא מצופה, אבל גם על זכוכית לכסות ECM מצופה. לבסוף, על מנת לצמצם autofluorescence הנפלט בינוני תרבות, המדיום תרבות קבוע כגון מגן סאנג M3, יש להחליף חיץ להטיס מלח פיזיולוגיים, כגון HL6, ממש לפני הדמיה.

באופן עקרוני, פרוטוקול זה יכול לשמש להכנת תאים ראשוניים של זבובים עם כל גנוטיפים, כגון מן הומוזיגוטים מניות מוטציה קיימא ופורה, ומתוך אלה אשר עוברים ניתן לבחור באופן ידני או על ידי סדרן המבוססת על ביטוי של GFP, או להביע רקמות ספציפיות Gal4, כטב"מ, גן גנוטיפ X. בשילוב עם שיטות ניסויים אחרים, פרוטוקול זה יאפשר מגוון של שאלות לטפל, במיוחד אלה הקשורים תאים מובחנים כמו הנוירונים והשרירים, קשה יהיה להתמודד עם שורות תאים בתרבית.