由紫外线引起的复制中间体的可视化 E。大肠杆菌使用二维的琼脂糖凝胶电泳分析

1。增长和紫外线照射。

1. 200μL新鲜隔夜生长在戴维斯中型¹辅以葡萄糖0.4％，0.2％casamino酸，和10微克/毫升胸腺嘧啶（DGCthy中型）和100μg/ mL氨苄青霉素质粒pBR322的文化沉淀。然后，细胞沉淀悬浮于200μLDGCthy缺乏氨苄青霉素介质和使用的预防针DGCthy中等20毫升。
2. 文化是生长没有氨苄青霉素选择一个摇床中于37 ° C为0.5外径_600（〜5 × 10 ⁸细胞/毫升）。没有氨苄青霉素增长避免了对异常或非生产性的复制中间体中可能出现的一些突变体的选择。此外，如果用紫外线光诱导损伤，从媒体清除氨苄青霉素是必要的，因为它吸收了强烈的细胞在这些波长和盾牌，减少紫外线的有效剂量。
3. 黄色的灯光下工作，文化是一个躁动的旋转平台上放置在直径15厘米的培养皿。我们的文化是放置在一个15瓦杀菌灯产生的〜1 J/m2/sec，这是使用紫外线光度计测量的照射量率的距离。文化是照射50 J/m2然后立即放回晃动在实验期间的37℃培养箱中培养。此剂量产生的，平均1环丁烷嘧啶二聚体每4.5 kb的单链DNA。黄色灯光防止光解环丁烷嘧啶二聚体的光复活逆转。

2。 DNA的提取。

1. 在复制中间体进行审查的时候，文化0.75毫升等分放入0.75毫升冰冷NET30缓冲区（pH值8.0，100毫米氯化钠，10毫米三，30毫米EDTA），并置于冰上，直到结束日久。我们通常运行90分钟的时间当然，研究样本为0，15，30，45，60和90分钟。 EDTA和低温的服务，以有效地制止复制和核苷酸切除修复。
2. 然后每个样品颗粒，悬浮于150μL1.5 mg / ml的溶菌酶和0.2 mg / ml的TE RNaseA（10毫米三，pH值8.0，1 mM EDTA的），并溶解在37 ° C为20分钟。此时，加入10μl蛋白酶K（10mg/ml的），并加入10μl20％sarkosyl的添加和孵化允许持续1小时。蛋白酶K和sarkosyl有助于释放酚抽提发生之前，可能与膜蛋白相关的DNA片段。由于积极DNA复制蛋白或膜复合物往往是必然的，这有助于增加产量恢复的复制片段。
3. 每个样品中加入2卷苯酚和管轻轻倒5分钟，然后提取样品。然后氯仿/异戊醇（24 / 1）2卷管轻轻再次倒立5分钟。
4. 在14000 RPM离心5分钟，每个样品的水相在离心样品被删除，并放置到一个新的管。然后添加4卷氯仿/异戊醇（24 / 1），管轻轻倒5分钟，再离心5分钟14,000转。
5. 顶部，每个样本中的水相，然后透析1小时，发现一个47毫米的Whatman 0.025微米孔径的硬盘，250毫升的0.1X TE漂浮在一个烧杯，每个样品100μL。由于更容易受到剪切，复制与单链地区或分支点的结构是我们通常切割用刀片枪头口更宽，并尽量减少剪切力。在一般情况下，移液应保持到最低限度，直到后的DNA用限制性内切酶消化。
6. 每个样本，然后消化PvuII（New England Biolabs公司）线性化质粒的复制起点的下游。
7. 在琼脂糖凝胶，100μL氯仿和6X样染料含有溴酚蓝和二甲苯蓝20μL加载之前被添加到每个样品和混合。然后，水样染料相40μl装入凝胶。为了最大限度地减少结构性偏差，结构构件和DNA剪切，这个分离过程中不包括任何的步骤，以丰富单链地区，沉淀，或集中的DNA样本，下面的细胞裂解。

3。双向凝胶电泳和Southern杂交分析。

1. 2维的琼脂糖凝胶电泳分析，修改3。第一维，限制的DNA样本是运行在1V/cm 1X TBE通过0.4％琼脂糖凝胶。一公升的10X TBE原液包含：
   • 108克三基地
   • 55克硼酸
   • 40毫升0.5M EDTA（pH值8.0）
2. 一个lambda的HindⅢ大小标记是在第一线加载，然后装入样品在每一个其他车道。我们通常运行的第一ðimension〜12-15小时。跳绳车道，使得更容易切片车道投中第二个维度。低电压和低％琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段的大小主要取决于服务。
3. 对于第二个层面，切胶道第一维凝胶使用一个大的屠刀。第一线包含的lambda的HindⅢ标记可以用溴化乙锭染色。为指导，作物使用的lambda的HindⅢ标记和丢弃凝胶低于线性质粒，预计运行的地区。在这些条件下，我们发现，线性pBR322的运行略高于二甲苯蓝染色。
4. 投第二个维度，每个泳道是横放跨越了一个空的凝胶施法的顶部。准备一个解决方案的1.0％琼脂糖1X TBE并冷却至55 ° C。此时，凝胶溶液倒在投第二个层面，以确保完全覆盖凝胶片。一旦凝胶，它是在6.5V/cm运行在电泳单位，允许循环缓冲区。我们通常运行的第二个维度〜5.5-7小时。有效的高电压和高％琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段根据其形状，以及大小。通过第二个维度，非线性形状运行更慢。
5. 以下电泳，凝胶，然后在H _{2 O的}冲洗，洗两次在0.25米盐酸400毫升15分钟，与H _{2 O}冲洗，然后两次在400毫升0.4M的NaOH冲洗30分钟。酸清洗服务成较小的片段，更有效地转移部分缺口的DNA分子。这一步是必要的，因为大尺寸和不同寻常的形状DNA复制中间体。
6. 凝胶的DNA，然后转移到一个Hybond ñ +尼龙^膜 4 。我们用0.4M氢氧化钠碱向下传输系统。简单地说，两片在0.4M NaOH溶液中浸泡吸墨纸放在大栈的纸巾。尼龙膜浸泡在0.4M氢氧化钠和放在吸墨纸上。在此之上，然后仔细分层凝胶的NaOH溶液中浸湿，另一块吸墨纸。最后，一​​个长片湿面纸是分层的顶部和其两端放置一个包含1 L 0.4M NaOH溶液作为灯芯的菜肴。我们通常让DNA转移为6-12小时。
7. 尼龙膜被删除，在5X SSC缓冲液洗20-30秒，并在10.5毫升预杂交溶液杂交辊瓶放置。然后，膜孵育在42℃，旋转超过6小时。预杂交的解决方案：
   • 5.0毫升甲酰胺
   • 0.5毫升，20％SDS
   • 2.5毫升20X SSC *
   • 2.0毫升50X登哈特*
   • 0.5毫升鲑鱼精DNA（10mg/ml的）
     * SSC和登哈特的食谱中可以找到5
8. 在预杂交期间，1微克质粒质粒缺口平移标记由罗氏制药公司使用标有[32 P] - dCTPα-提供的协议与32P。放射性标记的探针（100μL）是变性孵化在98 ° C为10分钟一个螺丝帽的离心管中，然后立即放在冰上。
9. 变性的探针加入5.9毫升的杂交液，其中包含：
   • 3.0毫升甲酰胺
   • 1.5毫升南南合作
   • 1.0毫升H _{2 O}
   • 0.15毫升50X登哈特的
   • 0.10毫升20％的SDS
   • 0.15毫升10mg/ml的鲑鱼精DNA
10. 预杂交的解决方案是泼出去的滚瓶，滚瓶，然后返回到42℃的孵化器和旋转超过12小时以上，杂交液浇入。
11. 杂交液是泼出去的滚瓶。然后，印迹洗20分钟〜150毫升一洗0.5X SSC，0.1％SDS在42 ° C的解决方案与旋转的辊瓶的4倍。
12. 膜是最后一次洗涤后，放在纸巾上，直到液体已明显消失。然后将滤膜聚氯乙烯保鲜膜包裹在接触到phosphorimager屏幕。我们可视化和量化的放射性，使用风暴840及其相关ImageQuant软件。

4。代表性的成果：

图1。质粒复制中间体的存在和由紫外线引起的DNA损伤的情况下观察。PvuII迁移模式消化质粒质粒2D -琼脂糖凝胶电泳分析观察图解。非复制的线性质粒作为一个线性的4.4 kb片段运行。复制的质粒，比非复制的片段，由于其尺寸较大的迁移速度较慢并没有形成Y形结构nlinear形状。这种迁移模式，形成一道弧线，从线性区域扩展以及对。紫外线照射后，双Y或X形分子观察锥地区的迁移速度比Y形分子的弧线。用32P标记的pBR322的探测的二维凝胶南分析的一个例子是细胞紫外线照射和紫外线照射（从出版商的许可复制）后15分钟后立即显示。

图1显示了典型的从野生型细胞的存在和紫外线损伤的情况下取得的结果。 〜1％的总质粒DNA损害的情况下，可以发现，在Y弧，当细胞迅速增长指数相。照射后，在Y形分子的瞬时增加观察堵塞的复制叉积累损坏的网站。 X形复制的中​​间体，也瞬时积累和坚持，直到一段时间，当病变修复相关。

南分析，可以砸出复制中间体的凝胶，用塑料吸管，纯化，并直接通过电子显微镜观察。我们已经用这种方法成功地识别过程中遇到的DNA损伤，并确定在这些突变体积累的异常复制中间体的复制叉需要的基因产物。此外，这种方法可以很容易地修改，以探讨其他形式的DNA损伤。