Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Para el siguiente protocolo, que utilizan las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) en las células de interés. Sin embargo, este protocolo podrá ser utilizado con otros tipos de células. Realizar el ensayo en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril.

Día 1: Preparación de las placas y las células

1. Sacar una placa de ELISPOT y abrirlo en el capó.
2. Lavar la placa 3 veces con 150 ml de 1X PBS utilizando una pipeta multicanal, si está disponible, pipeteado y otra solo es aceptable.
3. Saca un paquete de depósitos y abrirlo en el capó.
4. Añadir 2 mg / mL del anticuerpo de captura anti-humano interferón γ, a 11 mL de PBS 1X. Vortex bien. La transferencia de la mezcla de anticuerpos a un depósito.
5. Colocar 100 L de la solución de revestimiento en cada pocillo con el multicanal.
6. Envuelva el plato en parafina.
7. Colocar la placa en el refrigerador durante la noche. Las placas son buenas para la semana. La regla de oro es que si todavía queda líquido en los pozos, la placa se puede utilizar.

Preparación de células

Si el PBMCs son frescos y luego contar las células e incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO _2. Para PBMC almacenados en nitrógeno líquido, el deshielo de las células es necesario. El protocolo es el siguiente:

1. Descongele el criovial de las células a 37 ° C baño de agua hasta que esté casi completamente descongelado.
2. Inmediatamente resuspender en 5 ml de los medios de comunicación R10.
3. Girar durante 5 minutos a 225 x g.
4. Volver a suspender de nuevo en 5 ml de los medios de comunicación R10 y contar las células viables con azul de tripano.
5. Llevar a la concentración de 2 x 10 ⁶ células / ml en los medios de comunicación R10.
6. Descansar durante la noche a 37 º C con CO2 al _5%.

Día 2: Configurar la Plata

1. Etiqueta de la tapa la placa con el número de muestras de identificación, las condiciones del pozo, y la fecha.
2. Lavar la placa 6 veces con 150 l de PBS estéril 1x con el vertedero y el método de transferencia. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga. Esto podría provocar que los pozos de la placa de color morado.
3. Añadir 100 ml de R20 a cada pocillo.
4. Incubar la placa a 37 ° C durante 1 hora.
5. Mientras que la placa se está incubando, el recuento de las células que habían descansado durante la noche.
6. Haga girar la suspensión de células a 1500 rpm durante 5 minutos. Se decanta el sobrenadante y resuspender el precipitado para que tenga una concentración final de 1x10 ⁶ células por 1 mL en los medios de comunicación R10.
7. Después de la incubación de 1 hora, retirar el R20 con el vertedero y el método de transferencia. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga.
8. Añadir 100 ml de solución de células (10 ⁵ células) a cada pocillo. Añadir péptidos apropiado y / o los antígenos de los pocillos correspondientes por duplicado. Use una nueva punta cada vez que entra en la solución de péptido de trabajo. Concentración de péptido normal es de 10-40 mg / ml. Desde péptidos varían, cada investigador debe valorar péptidos para obtener resultados óptimos.
9. En los pocillos de control negativo, sólo agregar celdas (sin péptidos)
10. En los pocillos de control positivo, añadir la fitohemaglutinina (PHA, 10 mg / ml, Sigma).
11. Incubar toda la noche a 37 ° C con 5% de CO ₂ (~ 18 horas).

Día 3: El desarrollo de la Plata

1. Lavar la placa 6 veces con 150 l 1XPBS utilizando el método de descarga y transferencia.
2. Añadir 100 ml de PBS en cada pocillo de la placa con la pipeta multicanal.
3. Coloque el plato en el refrigerador durante 15 minutos.
4. Tome la placa de la nevera y colóquelo en la campana de cultivo de tejidos.
5. Prepare la solución de anticuerpos con biotina
   • Añadir 0,5 mg / ml de anticuerpos con biotina (MAB 7-B6-1) a 11ml de PBS.
   • Vortex la solución para mezclar bien.
   • Si planea agregar la solución con una multicanal, se vierte en un depósito.
6. Deseche el PBS accionando a la papelera. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga.
7. Colocar 100 L de la solución en cada pocillo.
8. Se incuba la placa en la capilla de cultivo de tejidos a temperatura ambiente durante una hora.
9. Se lava la placa 6 veces con 150μL 1XPBS utilizando el método de descarga y transferencia. En el lavado de 6 ^º, salir de la PBS en el plato hasta que haya preparado el anticuerpo estreptavidina.
10. Prepare el anticuerpo estreptavidina.
    • Añadir 5,5 μ l estreptavidina anticuerpos (estreptavidina-fosfatasa alcalina) de 11ml de PBS (dilución 1:2000).
    • Vortex la solución para mezclar bien.
    • Si planea agregar la solución con una multicanal, se vierte en un depósito.
11. Deseche el resto de PBS en los pocillos y secar la placa.
12. Añadir 100 ml de la solución de estreptavidina a cada pocillo.
13. Se incuba la placa en la capilla de cultivo de tejidos a temperatura ambiente durante 1 hora.
14. Lavar las placas 6 veces con PBS utilizando el método de descarga y transferencia. En el lavado de 6 ^º, salir de la PBS en el plato hasta que haya hecho la solución de color.
15. Trabajar en la oscuridad. Prepare la solución de sustrato de fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina sustrato Kit IV BCIP / NBT):
    • Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato 1 a 11 ml de tampón Tris, vórtice bien. Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato de 2 a Tris, vórtice bien. Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato de 3 a Tris, vórtice bien.
16. Deseche el resto de PBS y secar la placa.
17. Añadir 100 ml de la solución de color a cada pocillo de la placa con el multicanal.
18. Encienda la luz después de 5 a 10 minutos de color en desarrollo.
19. Dejar que los reactivos de color de permanecer en el plato hasta que las manchas comienzan a volverse púrpura y son bastante oscuras. Esto debe tomar entre 5 y 20 minutos. Tenga cuidado de no dejar la solución del sustrato en mucho tiempo, ya que hacerlo podría causar ruido de fondo alto.
20. Lavar la placa ELISPOT 3 veces con agua del grifo.
21. Dejar secar por una hora o toda la noche.
22. Lea la placa de forma manual o con lector de placas ELISPOT.
23. Guarde la placa en una caja lejos de la luz.

Los resultados representativos:

ELISPOT está diseñado para cuantificar la respuesta inmune contra los antígenos microbianos. Cada punto indica una célula de respuesta único, que expresa la citoquina de interés. Las manchas pueden ser contados manualmente o con un lector de placas ELISPOT.

Evaluación que el ELISPOT se ha realizado correctamente debe comenzar con la investigación del control negativo para la producción de la citoquina de fondo de interés. En los pozos de control negativo se podría esperar para ver sin puntos, aunque un poco de fondo (color morado) pueden estar presentes. Por lo general, no debe ser inferior a un promedio de cinco puntos por cada pozo. El control de los pozos positivos confirman que la reacción se ha realizado correctamente, y que las células responden a la estimulación antigénica. En los pocillos de control positivo que se puede esperar para ver un fondo de color morado oscuro, debido a una confluencia de puntos (Fig. 1). Debe haber poco o ningún fondo blanco. Si el control positivo y las muestras de control negativo son adecuados, uno puede contar con los pozos que contienen el antígeno de interés. A "subóptima" resultado sería reflejada por el fondo de alto (los pozos son de color púrpura), sin manchas o puntos muy pocos, el centro en blanco, puntos mal definidos o manchas confluentes. Una lista de consejos para solucionar problemas es siempre (Tabla 1).

Figura 1. Un representante de la placa de ELISPOT. Cada plato debe contener un control positivo, control negativo y el péptido de interés llevado a cabo en el mínimo de dos pozos. C9, C10, D9 y D10 son los pocillos de control positivo, como se puede ver que hay un profundo color púrpura, las células confluentes y casi ningún fondo blanco. Los pozos de control negativo son G11, G12, H11 y H12. Estos pozos no tienen fondo morado y sin manchas como se esperaba. Los puntos del G7, el G8, H7 y H8, ilustran las respuestas celulares a péptidos microbianos, los puntos púrpura representan una sola célula que expresa la respuesta de citoquinas de interés.

Tabla 1

El ensayo de ELISPOT se ha convertido en uno de los ensayos más importantes y ampliamente utilizado para controlar las respuestas inmunitarias en el ser humano y una variedad de otras especies. Con el ensayo de ELISPOT, las frecuencias de las células inmunitarias se puede medir a nivel celular individual sin la expansión o la manipulación de las poblaciones de células. ELISPOT se ha aplicado ampliamente para investigar antígeno de respuestas inmunes específicas en varias enfermedades, incluyendo infecciones, cáncer, alergias y enfermedades autoinmunes. La aplicación de este ensayo ha sido ampliamente aplicado a los estudios en la cuantificación de las células específicas de antígeno es crítica o comparación de la respuesta inmune a antígenos específicos en diversos estados de enfermedad, como la tuberculosis antes o después de ^un tratamiento con antibióticos. Sin embargo, informes recientes han demostrado que este ensayo puede ser utilizado para detectar la frecuencia de antígenos específicos de células T en materia de células aisladas, como el líquido ascítico, líquido cefalorraquídeo o lavado broncoalveolar. Sung-Han Kim et al. al. ha demostrado que utilizando el ensayo de ELISPOT en PBMC de pacientes con sospecha de tuberculosis abdominal, existe una sensibilidad del 89% para el diagnóstico de tuberculosis activa abdominal ^2. También se ha demostrado que el ensayo basado en células T ELISPOT tiene una sensibilidad del 91% para el diagnóstico de TB activa en pacientes con sospecha de afectación del sistema nervioso central por la tuberculosis utilizando la sangre periférica y líquido cefalorraquídeo células mononucleares ^3. Nuestro laboratorio utiliza el ensayo de ELISPOT para evaluar el reconocimiento celular de la micobacteria antígenos ESAT-6, en CMSP de pacientes con sarcoidosis. Este informe es importante porque muestra cómo el ensayo de ELISPOT se puede utilizar también como un método de diagnóstico para delimitar el papel de agentes infecciosos en enfermedades ^4,5 idiopática. Otra ventaja de este ensayo es que también permite la identificación de la tuberculosis en pacientes que han sufrido la vacuna BCG. El ensayo no está limitado por las condiciones de inmunosupresores como el uso de esteroides y la infección por VIH ^6. También ha facilitado la cuantificación y caracterización de los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-específicas CD8 + de células T ^7. Las respuestas, incluso se pueden detectar en los sujetos sanos a los antígenos microbianos, tales como Aspergillus fumigatus ^8. ELISPOT también se ha utilizado para identificar antígenos inmunodominantes de los sobrevivientes del síndrome cardiopulmonar por Hantavirus ^9, así como para evaluar la función de células T durante la infección crónica por el VIH ^10. Debido a la corta duración del cultivo in vitro, la respuesta medida refleja la imagen de la frecuencia de células T in vivo. El ensayo ELISPOT tiene el umbral de detección más bajos entre los "estándar" de ensayos de células T, tales como el ensayo de linfoproliferación (LPA) y el ensayo de linfocitos T citotóxicos (CTL). Este resumen ofrece una visión limitada de las enormes posibilidades de la relativamente simple, el ensayo de bajo costo. Las posibles aplicaciones de este ensayo continúan expandiéndose.