Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Voor de volgende protocol maken we gebruik van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) als de cellen van belang. Dit kan echter protocol worden gebruikt met andere celtypen. Voer de test in een weefselkweek kap met steriele techniek.

Dag 1: Voorbereiding van Plate en cellen

1. Neem een ​​ELISPOT bord en open het in de motorkap.
2. Was de plaat 3 maal met 150 ul van 1X PBS met behulp van een multichannel pipet, indien beschikbaar, anders een goed pipetteren aanvaardbaar is.
3. Neem een ​​pakket van reservoirs en open het in de motorkap.
4. Voeg 2 ug / ml van de capture antilichaam, anti-humaan interferon-γ, tot 11 ml van 1X PBS. Vortex goed. Overdracht antilichaam meng tot een reservoir.
5. Plaats 100 pl van de coating oplossing in elk putje met behulp van de meerkanaals.
6. Wikkel de plaat in parafilm.
7. Plaats de plaat in de koelkast overnachten. De platen zijn goed voor weken. De vuistregel is dat als er nog vloeistof die overblijft in de putten, de plaat kan worden gebruikt.

Celpreparaat

Als de PBMC's vers zijn dan de telling van de cellen en incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO _2. Voor de PBMC opgeslagen in vloeibare stikstof, ontdooien van de cellen nodig is. Het protocol is als volgt:

1. Ontdooi de cryovial van cellen in 37 ° C waterbad tot bijna helemaal ontdooid.
2. Onmiddellijk opnieuw in suspensie in 5 ml van de R10 media.
3. Spin gedurende 5 minuten bij 225 x g.
4. Resuspendeer weer in 5 ml R10 media en tel de levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw.
5. Breng concentratie 2 x 10 ⁶ cellen / ml in R10 media.
6. Rust 's nachts bij 37 ° C met 5% CO _2.

Dag 2: Opstarten van de Plate

1. Label plaat deksel met het monster identificatienummer, goed omstandigheden, en de datum.
2. Was de plaat 6 keer met 150 ul van steriele 1x PBS met behulp van de dump en de blot-methode. Wees voorzichtig niet om de plaat te spatten tijdens het dumping. Dit kan ertoe leiden dat de putjes van de plaat te draaien paars.
3. Voeg 100 ul van R20 aan elk putje.
4. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 1 uur.
5. Terwijl de plaat is incuberen, tel de cellen die 's nachts werden uitgerust.
6. Spin de celsuspensie bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. Giet het supernatant en resuspendeer de pellet, zodat je een uiteindelijke concentratie van 1x10 ⁶ cellen per 1 ml in R10 media.
7. Na 1 uur incubatie, verwijder de R20 met de dump en de blot-methode. Wees voorzichtig niet om de plaat te spatten tijdens het dumping.
8. Voeg 100 ul van cel-oplossing (10 ⁵ cellen) aan elk putje. Voeg het juiste peptiden en / of antigenen om de corresponderende putten in tweevoud. Gebruik een nieuwe pipettip elke keer dat je in de peptide-werkende oplossing. Normale peptide concentratie is 10-40 ug / ml. Sinds peptiden verschillen, moet iedere onderzoeker titreren peptiden om optimale resultaten te verkrijgen.
9. In de negatieve controle putten, alleen maar cellen (geen peptiden)
10. In de positieve controle putten, toe te voegen fytohemagglutinine (PHA, 10 ug / ml; Sigma).
11. Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO ₂ (~ 18 uur).

Dag 3: Ontwikkeling van de Plaat

1. Was de plaat 6 keer met 150 pi 1xPBS het gebruik van de dump en de blot-methode.
2. Voeg 100 ul PBS aan elk putje van de plaat met behulp van de multichannel pipet.
3. Zet de plaat in de koelkast gedurende 15 minuten.
4. Haal de plaat uit de koelkast en plaats deze in de weefselkweek kap.
5. Bereid de biotine antilichaamoplossing
   • Voeg 0,5 ug / ml van biotine antilichamen (MAB 7-B6-1) tot 11ml PBS.
   • Vortex de oplossing om goed te mengen.
   • Als u van plan om de oplossing toe te voegen met behulp van een multichannel, giet het in een reservoir.
6. Gooi de PBS door flicking het in de prullenbak. Wees voorzichtig niet om de plaat te spatten tijdens het dumping.
7. Plaats 100 pi van de oplossing in elk putje.
8. Incubeer de plaat in de weefselkweek kap bij kamertemperatuur gedurende een uur.
9. Was de plaat 6 keer met 150μL 1xPBS het gebruik van de dump en de blot-methode. Op de 6 ^e wassen, laat het PBS op de plaat tot u bereid de Streptavidine antilichaam.
10. Bereid de Streptavidine antilichaam.
    • Voeg 5,5 μ l Streptavidine antilichaam (streptavidine-ALP) naar 11ml PBS (1:2000 verdunning).
    • Vortex de oplossing om goed te mengen.
    • Als u van plan om de oplossing toe te voegen met behulp van een multichannel, giet het in een reservoir.
11. Gooi de PBS die nog in de putten en dep de plaat.
12. Voeg 100 ul van Streptavidine oplossing voor elk putje.
13. Incubeer de plaat in de weefselkweek kap bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
14. Spoel de platen 6 keer met PBS met behulp van de dump en de blot-methode. Op de 6 ^e wassen, laat het PBS op de plaat totdat je hebt gemaakt van de kleur oplossing.
15. Werken in het donker. De voorbereiding van de alkalische fosfatase substraat oplossing (alkalische fosfatase Substrate Kit IV BCIP / NBT):
    • Voeg 4 druppels substraat Reagens 1 tot 11 ml Tris-buffer, vortex goed. Voeg 4 druppels van substraat reagens 2 tot en met Tris-buffer, vortex goed. Voeg 4 druppels van substraat reagens 3 tot en met Tris-buffer, vortex goed.
16. Gooi de resterende PBS en dep de plaat.
17. Voeg 100 ul van de kleur-oplossing in elk putje van de plaat met behulp van de multichannel.
18. Doe het licht aan na 5 tot 10 minuten van kleur te ontwikkelen.
19. Laat de kleur reagentia te blijven op het bord tot aan de vlekken beginnen te draaien paars en zijn heel donker. Dit moet ergens van 5 tot 20 minuten. Wees voorzichtig niet aan de ondergrond oplossing te laten staan ​​te lang, want dit kan hoge achtergrond veroorzaken.
20. Was de ELISPOT plaat 3 maal met kraanwater.
21. Laten drogen voor ongeveer een uur of 's nachts.
22. Lees plaat manueel of met ELISPOT plaat lezer.
23. Bewaar de plaat in een doos uit de buurt van blootstelling aan licht.

Representatieve resultaten:

ELISPOT is ontworpen om immuunrespons kwantificeren tegen microbiële antigenen. Elke plek markeert een afzonderlijke responsieve cel, de uiting van de cytokine van belang. De vlekken kunnen handmatig of met behulp van een ELISPOT plaat lezer worden geteld.

Beoordeling dat de ELISPOT correct is uitgevoerd zou moeten beginnen met het onderzoek van de negatieve controle voor de achtergrond de productie van het cytokine van belang. In de negatieve controle putten men zou verwachten dat geen vlekken te zien, hoewel een beetje achtergrond (paarse kleur) aanwezig kunnen zijn. Normaal gesproken, zou er minder dan een gemiddelde van vijf spots per goed. De positieve controle putten te bevestigen dat de reactie correct is uitgevoerd en dat de cellen reageren op antigene stimulatie. In de positieve controle wells je zou verwachten dat een diep paarse achtergrond te wijten aan een samenloop van spots (Afb. 1) te zien. Er moeten weinig tot geen witte achtergrond. Als de positieve controle en negatieve controlemonsters geschikt zijn, kan men dan tellen de putten met het antigeen van belang. Een "niet optimaal" resultaat zou worden weerspiegeld door de hoge achtergrond (de putten zijn paars), geen vlekken of zeer weinig vlekken, leeg centrum, slecht gedefinieerde plekken of confluent vlekken. Een lijst met tips wordt voorzien (tabel 1).

Figuur 1. Een vertegenwoordiger van ELISPOT plaat. Elke plaat moet een positieve controle, negatieve controle en peptide van interesse uitgevoerd op het minimum in twee putten. C9, C10, D9 en D10 zijn de positieve controle putten, zoals je kunt zien is er een diep paarse kleur, samenvloeiende cellen en nauwelijks een witte achtergrond. De negatieve controle putten zijn G11, G12, H11 en H12. Deze putten hebben geen paarse achtergrond en geen vlekken zoals verwacht. De vlekken G7, G8, H7 en H8, illustreren cellulaire reacties op microbiële peptiden, de paarse vlekken vormen een reagerende cel die het cytokine van belang.

Tabel 1

De ELISPOT assay heeft ontpopt als een van de belangrijkste en meest gebruikte testen om te controleren immuunrespons bij de mens en een verscheidenheid aan andere soorten. Met de ELISPOT-test, kan het immuunsysteem cel frequenties worden gemeten aan de enkele cel niveau zonder uitbreiding of manipulatie van celpopulaties. ELISPOT test is op grote schaal toegepast om antigeen specifieke immuunrespons te onderzoeken in verschillende ziekten, waaronder infecties, kanker, allergieën en auto-immuunziekten. De toepassing van deze test is grotendeels van toepassing op onderzoeken waar de kwantificering van de antigeen-specifieke cellen is kritisch of vergelijking van de immuunrespons op specifieke antigeen bij diverse ziektebeelden, zoals tuberculose voor of na ^een behandeling met antibiotica. Echter, recente rapporten aangetoond dat deze test kan worden gebruikt om de frequenties van antigeen-specifieke T-cellen te detecteren binnen geïsoleerd celmateriaal, zoals de ascites vloeistof, cerebrospinale vloeistof of bronchoalveolaire lavage. Sung-Han Kim et. Al. heeft aangetoond dat met behulp van de ELISPOT-test op PBMC van patiënten verdacht van abdominale tuberculose, is er een sensitiviteit van 89% voor het diagnosticeren van actieve buik TB ^2. Het is ook aangetoond dat de T-cel op basis van ELISPOT-test een 91% sensitiviteit voor de diagnose van actieve tuberculose bij patiënten met een verdenking van het centrale zenuwstelsel betrokkenheid van tuberculose behulp van een perifeer bloed en hersenvocht mononucleaire cellen ³ had. Ons laboratorium maakt gebruik van de ELISPOT-test om cellulaire herkenning van mycobacteriële antigen ESAT-6 in PBMC beoordelen van sarcoïdose patiënten. Dit rapport is belangrijk omdat het laat zien hoe de ELISPOT-test kan ook worden gebruikt als een diagnostische methode om een rol voor infectieuze agentia af te bakenen bij idiopathische aandoeningen ^4,5. Een ander voordeel van deze test is het ook de identificatie van tuberculose bij patiënten die hebben ondergaan BCG-vaccinatie mogelijk maakt. De test is niet beperkt door een immunosuppressieve voorwaarden, zoals het gebruik van steroïden en HIV-infectie ^6. Zij heeft ook de kwantificering en karakterisering van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV)-specifieke CD8 + T-cel responsen ^7. Reacties kunnen zelfs worden gedetecteerd bij gezonde proefpersonen op microbiële antigenen, zoals de Aspergillus fumigatus ^8. ELISPOT is ook gebruikt om immunodominante antigenen identificeren van overlevenden van Hantavirus cardiopulmonale syndroom ^9, alsook aan T-cel functie te beoordelen tijdens chronische HIV-infectie ^10. Vanwege de korte-termijn in vitro cultuur, de gemeten respons spiegels nauw aan bij de in vivo T-cel frequentie. De ELISPOT test heeft de laagste detectiegrens onder de 'standaard' T-cel-assays, zoals de lymfoproliferatie assay (LPA) en cytotoxische T lymfocyten (CTL) test. Deze samenvatting geeft slechts een beperkt beeld van de enorme mogelijkheden van de relatief eenvoudige, goedkope test. De mogelijke toepassingen van deze test verder uit te breiden.