Dissecção da Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster

Joshua J. Krupp, Joel D. Levine

Department of Biology, University of Toronto

Parte 1. Preparação filé do abdômen Drosophila adulto.

O procedimento descrito abaixo imediata prepara o abdômen para a posterior remoção da oenocytes (ver Part2 de protocolo). O mesmo procedimento também pode ser usado para a preparação de outros tecidos ligados à superfície interna da cutícula, incluindo o vaso dorsal (isto é, o coração) e gordura corporal.

Note que no artigo de vídeo a técnica de dissecação oenocyte é demonstrado em um adulto de tipo selvagem voar (Canton-S) do sexo masculino, seis dias de idade. Técnicas idênticas podem ser usados ​​para remover o oenocytes de moscas fêmeas. A preparação filé abdômen leva aproximadamente 5 minutos para executar.

Antes de começar é importante ter em mãos vários pinos de dissecção fina (ver abaixo e Parte 2) e uma agulha de dissecção (ver Parte 2). Pinos dissecção disponíveis comercialmente e agulhas são muitas vezes demasiado grandes para este protocolo, por isso temos levado para fabricar nosso próprio laboratório. Para criar a agulha de dissecação fio de tungstênio, (0,005 ") é a primeira enfiada através do eixo da agulha hipodérmica (27G, alumínio hub). Passe o fio através da ponta da agulha hipodérmica para que emerge do hub. Crimp o fio salientes de hub;. isso impede que o fio seja puxado para fora da agulha hipodérmica Em seguida, corte o fio na extremidade oposta do tal de cravar que vários milímetros (~ 3-4mm) de fio se projetam a partir da ponta da agulha hipodérmica Passing. a ponta de tungstênio exposta através de uma chama irá aguçar o fio a um ponto muito bem. Uma pipeta de plástico descartáveis ​​5ml, quando preso no cubo da agulha hipodérmica atua como lidar com esta ferramenta conveniente para dissecção. Os pinos dissecção fina são feitas de forma semelhante caminho. Após a etapa de nitidez, segure a ponta do fio firmemente com uma pinça para evitar que se mova e fazer um corte de aproximadamente 3mm da ponta para liberar o pino de dissecção de pequeno porte. Tome cuidado para evitar que o pino de ser lançados a partir da compreensão da a pinça.

Para preparar o filé de abdômen Drosophila adulto:

1. Assegurar a voar para a placa de dissecção (Sylgard; Dow-Corning), colocando um pino dissecção fina que o tórax.
2. Remove as pernas e as asas da mosca. Ao remover o conjunto mais posterior das pernas, criar uma abertura na cutícula no ponto anterior apenas para onde o tórax do abdômen encontra. Esta abertura é usado posteriormente como um ponto de acesso para fazer uma incisão ao longo da superfície ventral do abdome (ver Etapa 5)
3. Garantir o abdômen da mosca no lugar, colocando um pino dissecção segundo através do segmento genital.
4. Cobrir a voar com Shields refrigerados e Sang inseto M3 médio (Sigma). Remover o ar, chamando-a com uma pipeta Pasteur.
5. Forceps usando abrir o abdómen, fazendo uma incisão ao longo da linha mediana ventral desde a abertura na cutícula criado por eliminar as pernas para o segmento genital. Retire as tripas e gônadas do abdômen.
6. Sever a cutícula e traquéias de ligar o abdômen para o tórax. O tecido único remanescente de ligar o abdômen para o tórax deve ser o coração. Isto proporciona a cutícula abdominal com alguma estabilidade, e impede que esta rotação ou torção durante a próxima etapa.
7. Pin plano da anterior maioria dos cantos da cutícula abdominal. Remover o tórax. Puxando a cutícula tenso, pin flat os cantos posterior da cutícula. O pino no segmento genital pode precisar ser reposicionado para fazer a cutícula colocar o plano.

Parte 2. Dissecção Oenocyte

A preparação filé abdômen expõe a superfície interna da cutícula abdominal e tecidos em anexo, incluindo o coração, gordura corporal, traquéia, músculos da parede do corpo, a epiderme, e os oenocytes. O coração fica ao longo da linha média dorsal. De gordura corporal (tecido opaco) cobre a maior parte da superfície interna cuticular. Traquéias (branco estruturas tubulares) se estendem desde as aberturas espiráculo lateral, e fazer ramos extensos que se infiltram nesses tecidos. Deitado debaixo destes tecidos, o oenocytes pigmentadas (de cor âmbar células) irradiam a partir da linha média para a borda lateral da cutícula na região posterior de cada segmento. O oenocytes estão diretamente sob o bronzeado regiões de cada tergito (dorsal placas cuticular) e pode ser difícil identificar, sem conhecimento prévio da sua localização. Outra população de oenocytes ventralmente localizada está associada com a sternites (ventral placas cuticular), embora seja possível isolar estas células, este protocolo de vídeo só vai demonstrar a dissecção da oenocytes dorsal. Em cada segmento abdominal, uma folha de destaque de tecido de gordura corporal está anterior à oenocytes; uma pequena folha menos óbvias de gordura corporal encontra-se posterior ao oenocytes. A folha de destaque de tecido de gordura corporal, muitas vezes cobre a oenocytes do segmento precedente. O vaso dorsal e de gordura corporal deve ser removido no primeiro fim de expor o oenocytes.

É importante notar que a pigmentação amarela da oenocytes, da qual deriva o nome de seu (Oeno - do grego oinos, "vinho") ^1, distingue claramente estas células dos tecidos circundantes, a intensidade da pigmentação aumenta com a idade da mosca. Além disso, uma lâmina basal ensheathes a ^2,3 oenocytes, dando suporte aos grupos de células e prevenindo que as células se tornem dissociada durante a dissecção. A lâmina basal também ajuda na remoção de tecidos extraneously aderido, como o tecido de gordura corporal, através da criação de um ponto fraco, onde estas aderências pode ser facilmente rompido.

O procedimento descrito a seguir fornece instruções detalhadas para a remoção do oenocytes do tegumento abdominal. O oenocytes pode ser facilmente removido segmentos abdominais 2-5 (masculino) e 06/02 (feminino). O oenocytes do primeiro e último segmentos abdominal (segmentos 1 e 6 do sexo masculino ou 7 no feminino) são muitas vezes interrompidas pelos pinos dissecção segurando os cantos da cutícula e são, portanto, evitado. A remoção do oenocytes leva aproximadamente 10 minutos para executar.

Para isolar o oenocytes adulto:

1. Sever do tronco traqueal que emana do espiráculos usando uma agulha de dissecção.
2. Remover a gordura corporal e do coração, cortando as ligações à superfície interna da cutícula com uma agulha de dissecção. Para isso, posicione o ponto da agulha dissecção entre a gordura corporal ea oenocytes, e arrastá-lo a partir da borda lateral da cutícula, através da linha média, passando por baixo do coração, e continuando para o lado oposto. Progredindo do posterior ao anterior, remover o tecido de gordura corporal e do coração da cutícula de cada segmento sucessivo. Se realizada com cuidado o oenocytes permanecer solidários com a cutícula, ea gordura corporal e do coração pode ser removido todo.
3. Corpo de parede tira os músculos do oenocytes à superfície interna da cutícula. Utilizando a agulha de dissecção romper os músculos do corpo longitudinal parede de cada segmento. Para fazer isso, arraste a agulha de dissecção ao longo do lado posterior da vertente oenocyte, levantando-os suavemente a partir da superfície da cutícula. Os fios fita-como oenocyte deve vir longe da cutícula e podem ser estabelecidas para o lado enquanto o oenocytes restantes são removidos.
4. Uma vez retirado da cutícula e deitado na placa de dissecação, pode ser necessário para limpar qualquer aderido ao tecido de gordura corporal a partir do oenocytes. Isto é feito simplesmente colocando a agulha de dissecção entre o tecido de gordura corporal ea oenocytes, e cortando a ligação, empurrando a agulha para baixo e contra a placa de dissecação.
5. Recolher os fios oenocyte simplesmente cutucando-os com a ponta da agulha de dissecção. Uma vez preso à extremidade da agulha de dissecação do oenocytes pode ser puxado lentamente em toda a superfície do meio de cultura. O oenocytes dissecados pode ser colocado diretamente em tampão de lise celular apropriado para tanto RNA ou extração de proteínas. Note que o oenocytes (segmentos abdominais 2-5) a partir de uma mosca macho normalmente produz 15 20ng de RNA total.

Figura Legenda:

Figura 1. Expressão dos genes desaturase, desat1 e desatF, em oenocytes macho e fêmea de D. melanogaster. amplificação de transcrição reversa-PCR de desat1 e desatF de cDNA derivado de adultos oenocytes masculino e feminino. O gene é expresso em desat1 oenocytes tanto masculino e feminino; expressão desatF é sexualmente dimórfico, sendo expresso exclusivamente em oenocytes feminino. Correspondentes a estas diferenças na expressão gênica, desat1 é necessária para a produção de compostos de hidrocarbonetos comuns a ambos os homens e mulheres ^9, e desatF está envolvido na produção de compostos de hidrocarbonetos especificamente feminino ^10,11. DesatF foi mostrado para ser especificamente expressos em oenocytes feminino por em ¹² de hibridização in situ. Note-se que, em média, 15 20ng de RNA total é obtido a partir da oenocytes dissecada a partir de uma mosca individual. RNA foi isolado usando o micro RNeasy kit (Qiagen); cDNA foi produzido usando o qScript síntese cDND kit (Quanta BioSciences)