从成人Oenocytes剖析果蝇

Joshua J. Krupp, Joel D. Levine

Department of Biology, University of Toronto

第1部分。圆角准备的成年果蝇腹部。

立即在下面的准备过程概述腹部oenocytes随后拆除（见议定书第2部分）。同样的程序也可以用于连接到内表面的角质层的其他组织，包括背血管（即心脏）和脂肪体的准备。

请注意，在视频文章oenocyte夹层技术是成年的野生型（广东）男飞，6天的年龄证明。相同的技术可以用于去除雌蝇oenocytes。腹部圆角准备大约需要5分钟来执行。

开始之前重要的是有准备的罚款几个清扫引脚（见下文第2部分）和一个夹层针（见第2部分）。市售清扫如坐​​针毡此协议往往过大，所以我们已在实验室中制造我们自己的。要创建解剖针，钨丝（0.005“）是第一个线程通过皮下注射针头的轴（27G，铝轮毂）。主题导线通过皮下注射针头的尖端，使其从集线器出现。压线凸出枢纽;防止拔出注射针丝下一步，切压等几个毫米的导线（约3 - 4mm的）从注射针的尖端突出的另一端线的传递。通过火焰的尖端暴露钨丝会激化到非常细点。一个一次性5毫升的塑料吸管时注射针枢纽楔形此清扫工具方便处理的行为。罚款清扫引脚类似使用方式。锐化一步后，抓紧与钳非常尖端的电线，以防止其移动和禁约3mm的尖端释放的小夹层针。护理，防止针被从遥远的把握镊子。

要圆角准备成年果蝇腹部：

1. 安全飞行夹层板（Sylgard;陶氏 - 康宁）置于胸部虽然罚款解剖针。
2. 删除飞的腿和翅膀。虽然卸下腿最后的设置，创建点前胸部符合腹部在角质层的开放。这种开放是作为一个接入点，沿腹部腹面切口后（见步骤5）
3. 安全飞上腹部生殖器段第二解剖针。
4. 盖飞用冷冻肉盾牌和桑供应M3的昆虫培养基（Sigma公司）。用巴斯德吸管吸取删除任何被困的空气。
5. 使用镊子打开腹部，沿腹中线消除腿部生殖器段创建角质层开幕切口。删除从腹部的胆量和性腺。
6. 断绝角质层和气管连接到胸部腹部。剩下的唯一的组织连​​接到胸部腹部应心。这提供了一些稳定的腹部角质层，防止旋转或扭曲在下一步。
7. 针扁平的腹部角质层最前的角落。取出的胸部。拉角质层绷紧，针扁平的角质层后的角落。在生殖器段的脚可能需要重新定位，使角质层平放。

第2部分。 Oenocyte夹层

腹部圆角准备公开腹部角质层和连接的组织，包括心脏，脂肪体，气管，体壁肌肉，表皮，和oenocytes的内部表面。核心在于沿背中线。脂肪体（不透明的组织），涵盖最内部的表皮表面。气管（白管状结构）从横向气门开口，延长，并广泛渗透到这些组织的分支机构。躺在这些组织下，色素oenocytes（琥珀色细胞）从中线外侧边缘的角质​​层在各分部后地区的辐射。 oenocytes在于直接下每个背片（背表皮板）的重水复疑无路鞣制的地区，可没有事先了解自己的位置难以确定。另一个腹侧位于oenocytes人口与sternites（腹侧表皮板），虽然有可能分离出这些细胞，这个视频协议只能证明背oenocytes清扫。在各腹节，脂肪体组织中的一个突出的叶在于前的oenocytes;脂肪体叶片较小的不太明显的谎言后的oenocytes。脂肪体组织中的突出叶往往涵盖了oenocytes的前面部分。背血管和脂肪体，必须先移除，以揭露的oenocytes。

重要的是要注意的oenocytes琥珀色素沉着，从他们的名字来源于（奥埃诺-从希腊 oînos，“酒^”）1，明确区分这些细胞从周围组织的色素沉着的强度与年龄的增长苍蝇。此外，基底层ensheathes oenocytes ^2,3，提供支持的细胞团，并防止成为在解剖分离的细胞。基底层还取消extraneously坚持组织，如脂肪体组织，在艾滋病，通过创建一个薄弱点，这些粘连，可以很容易地扰乱。

下文概述的程序提供了详细说明oenocytes去除腹部包膜。 oenocytes可以很容易地从腹部段2-5（男），和2-6（女）。解剖控股的角质层的角落引脚的第一个和最后一个腹段（段1，男性或女性7）oenocytes往往打乱，并因此避免。取消oenocytes大约需要10分钟来执行。

要隔离成人oenocytes：

1. 使用夹层针的气孔产生，切断气管树干。
2. 切断连接到内表面的角质层与解剖针取出脂肪的身体和心。要做到这一点，位置的夹层之间的脂肪体和oenocytes针点，并拖动从外侧边缘的角质​​层，通过中线，心脏下方移动，并持续到对面。进步从后到前，去除脂肪的身体组织，从每个连续段的角质层和心脏。如果进行仔细oenocytes保持角质层，和肥胖的身体和心可以删除整个。
3. 体壁肌肉表带oenocytes内表面的角质层。用解剖针断绝每个段的纵向体壁肌肉。要做到这一点，拖oenocyte链后，解剖针，轻轻提起他们从表面的角质层。剪彩像oenocyte股应该远离角质层，可铺设到一边，而其余oenocytes被删除。
4. 一旦从角质层，躺在夹层板，它可能是必要的清理关闭任何坚持从oenocytes脂肪的身体组织。这是只需将夹层之间的脂肪体组织和oenocytes针，针推下来，对夹层板和切断连接。
5. 通过简单地用解剖针戳他们收集oenocyte股。一旦坚持到oenocytes可以拉出整个培养基表面慢慢解剖针年底。解剖oenocytes可以直接放到适合RNA或蛋白质提取的细胞裂解液。请注意，从单一的男性飞oenocytes（2-5腹节）通常产量15 - 20ng的总RNA。

图例：

图1。表达的去饱和酶基因，desat1和desatF D 的男性和女性oenocytes， 果蝇 。逆转录- PCR扩增，从cDNA desat1 和 desatF成年男性和女性oenocytes的所得。 desat1基因的表达在男性和女性oenocytes; desatF表达的是性二态，女性oenocytes表示。通讯desat1这些基因的表达差异，是为烃类化合物，常见的男性和^女性 9的生产需要，参与的女性特有的烃^类化合物10,11的生产 desatF。desatF已被证明是具体 ​​表现在女性oenocytes 原位杂交^12。请注意，平均15 - 20ng总RNA是从个别飞解剖oenocytes获得。 RNA的提取使用的RNeasy微型试剂盒（Qiagen）的cDNA使用qScript cDND合成试剂盒（广达生物科技公司生产）