Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into French was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

1, 2, 2

1Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin-Madison, 2Pathobiological Sciences, University of Wisconsin-Madison

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.234.231.49, User IP: 54.234.231.49, User IP Hex: 921364273

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells. J. Vis. Exp. (45), e2250, doi:10.3791/2250 (2010).

Abstract: Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

Carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) peut être utilisé facilement et rapidement l'étiquette d'une population cellulaire d'intérêt pour l'enquête in vivo. Cet étiquetage a été classiquement utilisé pour étudier la prolifération et la migration. Dans la méthode présentée ici, nous avons raccourci les délais, après le transfert adoptif de regarder la survie et la mort de cellules CFSE épitope spécifique cible marquée 4-6. Le niveau de destruction spécifique d'un clone cellulaire T CD8 + peuvent indiquer la qualité de la réponse, que leur quantité peut être trompeur. Spécifiques cellules T CD8 + peuvent devenir fonctionnellement épuisées au cours du temps avec une baisse de la production de cytokines et de tuer 7,8. En outre, certains clones CD8 + des lymphocytes T ne peut pas tuer ainsi que d'autres avec différentes spécificités TCR 9. Pour immunité à médiation cellulaire efficace (CMI), les antigènes doivent être identifiés qui produisent non seulement un nombre suffisant de répondre cellules T, mais aussi fonctionnellement robustes cellules T répondant. Ici nous évaluons la destruction des cellules spécifiques de deux pour cent peptide spécifique des clones de lymphocytes T dans souris Balb / c.

Protocol: Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

1. Solliciter la cible des CTL spécifiques effectrices par la vaccination (jour 0)

  1. Avant de commencer, décider d'un effecteur spécifique: le système cible. Dans cet exemple d'un classique in vivo de CTL dosage, nous allons utiliser une vaccination peptide purifié à susciter spécifiques des cellules T CD8 +. Le même peptide sera utilisé pour les cellules cibles d'impulsion syngéniques, la création d'un effecteur spécifique: le système cible. Alternativement, vous pouvez choisir d'utiliser tout ou protéines pathogènes pour obtenir votre effecteurs et cibles spécifiques.
  2. Décontaminer la surface de travail à l'intérieur d'un capot de biosécurité afin de garantir la stérilité des injections. Préparer la vaccination peptide en plaçant d'abord 50 mg de peptide purifiés en 100 uL DMSO 10% dans du PBS / souris contenue dans un tube de 2 mL. Ensuite, ajoutez une quantité égale de très froid adjuvant incomplet de Freund et jusqu'à la marque 0,2 ml avec 1 mm pour le mélange des perles. De ce point, garder immunogène la glace jusqu'à l'injection. Couvercle sécurisé avec du parafilm.
  3. Utilisez un batteur perles mis à RPM maximal de mélanger l'émulsion pendant 3 minutes, rapidement placer l'émulsion retour sur la glace après le mélange. L'émulsion résultante devrait être similaire en consistance à la mayonnaise. Autoriser émulsion de s'asseoir à 4 ° C pendant la nuit, si le temps le permet (jusqu'à une semaine), en mélangeant encore si toute séparation est noté.
  4. Utiliser une seringue de 1 mL et de 20 ou 20,5 aiguille de la jauge de remonter d'émulsion en faisant attention à ne pas tirer vers le haut toute perles (perles doit être supérieure à calibre de l'aiguille, mais toujours être au courant).
  5. La souris sécurisé pour injection sous-cutanée à la base de la queue. Nous utilisons un plastique de 50 ml modifiés tube conique en toute sécurité et en douceur d'immobiliser la souris pour l'injection. Injecter la souris avec 0,2 mL d'émulsion.

2. Cellules cibles de récolte (Jour 8)

  1. Vous aurez besoin de souris syngéniques naïves pour vos cellules cibles. Euthanasier souris naïves conformément aux normes AAALAC.
  2. Désinfectez la souris par pulvérisation d'éthanol à 70% afin de minimiser les risques de contamination à partir des cheveux de souris ou d'autres contaminants extérieurs.
  3. Avec des ciseaux de dissection font snip petits travers de la peau sur le côté gauche de la souris. Tirez lambeau de peau plus à découvrir sac péritonéal et les organes internes.
  4. Snip à travers le péritoine, en faisant attention de ne pas compromettre l'un des organes sous-jacents. La rate est proche de la surface et est similaire en couleur pour le foie (rouge foncé) mais plus petite et plus de haricots de rein en forme. Les souris infectées montrent généralement plus grandes que la rate, notamment des témoins non infectés.
  5. Retirez doucement la rate, en prenant soin d'être doux pour ne pas briser la rate en plusieurs morceaux afin de récupérer au maximum le nombre de cellules. Placer immédiatement la rate dans une conique 15 ml contenant 10 ml de milieux préparés sur la glace. Continuer avec les souris restantes.
  6. Verser le contenu du tube 15 ml conique (médias et la rate) dans un broyeur de tissus de verre. Broyer la rate en utilisant beaucoup de force du bras. Lorsque tout le tissu a perdu sa couleur, vous pouvez supposer que vous avez récupéré toutes les cellules de tissu conjonctif.
  7. Verser le contenu de la meuleuse à travers un filtre 70 microns de cellules dans un tube conique de 50 ml. Rincez meuleuse avec les médias fraîche et versez dans une passoire cellule.
  8. Centrifuger à 4 ° C, 1300 RPM pendant 7 minutes. Verser le liquide surnageant.
  9. Remettre en suspension dans 10 ml de réactif de lyse préparé et incuber à 37 ° pendant 7 minutes.
  10. Ajoutez jusqu'à 50 ml avec les médias frais et centrifugeuse, comme ci-dessus.
  11. Remettre en suspension dans les médias MLS 50 frais et centrifugeuse, le même que ci-dessus (étape de lavage). * Remarque: En ce moment vous pouvez effectuer une séparation magnétique de cellules d'un type de cellule spécifique (les macrophages par exemple), si une population cible de cellules pures est souhaitée pour le transfert dans des souris receveur. Aussi, à ce moment vous pouvez introduire un traitement expérimental dans la culture afin d'étudier les effets de ce traitement sur la destruction spécifique des cellules.
  12. Compter les cellules et la plaque 1 x 10 7 par puits dans 100 ul dans une plaque 96 puits de culture tissulaire rondes en bas traitées. * Ceci est une forte concentration de cellules / puits, mais parce que le dosage est un rapide, nous n'avons vu aucune perte de viabilité des cellules à cette concentration.

3. Traitement et marquage des cellules cibles

  1. Pulse cellules appropriées et reproduit avec le peptide d'organismes pathogènes spécifiques ou de contrôle peptide non pertinent: Ajouter 1 ug / ml de peptide. Incuber à 4 ° C pendant 1,5 heures. Déplacer à 37 ° C incubateur pour durer 30 minutes. Pendant ce temps préparer le réactif CFSE.
  2. Préparer CFSE selon les spécifications du fabricant et diluer à une concentration de travail entre 0,5 et 25 um. Faire «faible» de concentration 10x plus faible que la concentration CFSE «élevé». Par exemple, pour [faible] ajouter 0,5 uL CFSE à 10 ml de PBS et pour [haute], ajouter 5 uL CFSE à 10 ml de PBS. CFSE chaud préparé à 37 ° C avant d'étiquetage.
  3. Retirer la plaque de cellules de l'incubateur et pEllet dans une centrifugeuse à grande vitesse à la température ambiante, 1300 RPM pendant 7 minutes. Flick pour enlever le surnageant.
  4. Resuspendre les cellules dans les deux [faible] ou [haute] CFSE en ajoutant 200 ul de réactif appropriés dans les puits correspondants et incuber pendant 15 minutes à 37 ° C.
  5. Retirer la plaque de cellules de l'incubateur et encore de bouletage à température ambiante, 1300 RPM pendant 7 minutes. Flick pour enlever le surnageant.
  6. Resuspendre les cellules dans 200 ul / puits de réchauffé milieux frais et incuber pendant 30 minutes à 37 ° C.
  7. Retirer la plaque de cellules provenant de pépinière et de culot à température ambiante, 1300 RPM pendant 7 minutes. Flick pour enlever le surnageant.
  8. Resuspendre les cellules dans 100 ul / puits de PBS.
  9. Pour le transfert adoptif, ajoutez un puits [faible] cellules marquées d'un puits [haute] cellules marquées par souris. Résultant d'injection devrait être de 50% des objectifs spécifiques et 50% des cellules sans pertinence dans 0,2 ml.
  10. Ne pas oublier de mettre de côté certaines cellules marquées d'agir comme vos contrôles non transférés lors de l'analyse des données et pour l'exécution sur le cytomètre en flux (voir figure 1).

4. Le transfert adoptif

  1. Anesthetize préalablement peptide souris immunisées (de la partie # 1 du présent protocole) conformément aux normes AAALAC.
  2. Injecter 0,2 ml de cellules cibles marquées par rétro-orbitaires itinéraire dans souris receveuses.
  3. Attendre 6 heures ou toute autre durée prédéterminée optimale avant euthanasier les souris receveuses.

5. Récolte cellules marquées

* Remarque: Les étapes 5.1 à 5.11 sont les mêmes que les étapes 2.1 à 2.11

  1. Compter les cellules et la plaque à moins 1 x 10 6 par puits dans 100 ul en 96 culture sur le fond de tissu bien ronds plaque traitée.
  2. Fixer les cellules récupérées et non transférés en ajoutant 100 uL paraformaldéhyde 2% à une concentration finale de paraformaldéhyde 1% à tous les puits.

6. Cytométrie en flux et analyse de données

  1. Exécuter des échantillons sur un cytomètre en flux et analyser les données.

7. Les résultats représentatifs

Un pic épitope diminution spécifique sur l'histogramme qui en résulte est un indicateur de la destruction spécifique des cellules (figure 1). Utilisez les équations suivantes (appliquée dans le tableau 1) pour déterminer la valeur réelle de lyse spécifique des cellules:
Ratio = Pourcentage pertinent: Epitope pourcentage déterminé (pic [faible]: [haute] de pointe),
Lysis pour cent spécifique = [1 - (rapport de contrôle non-transfert / rapport expérimental)] x 100

Figure 1
Figure 1. Profil CFSE des numéros récupérés splénocytes de souris Balb / c. Indiquer le pourcentage de cellules de phénotype CFSE haute ou basse. A) Non-transfert de contrôle. Tous [haute] CFSE pics représentent épitope des cellules cibles spécifiques, tandis que [faible] pics CFSE représentent des cibles pulsées avec le peptide non pertinentes. B) les cellules CFSE étiquetés récupéré de la souris immunisées bénéficiaires PBS (contrôle). C) les cellules CFSE étiquetés récupéré de deux souris différentes peptide destinataire spécifique, notez les pics épitope diminuée précises.

Figure 2
Figure 2. Représentation graphique des données analysées. Trois points de données indiqué pour chaque groupe de souris, PBS, peptide A et B. Peptide

Exemple Epitope% CFSE HAUTE pulsé % CFSE BASSE Irrelevant Low Ratio: High Tuer pour cent Epitope spécifiques
PBS 42,8 57,2 1,34 16,97
PBS 43,1 56,9 1,32 15,94
PBS 44,3 55,7 1,26 11,74
Peptide A 39,7 60,3 1,52 32,56
Peptide A 38,6 61,4 1,59 35,61
Peptide A 40,6 59,4 1,46 29,99
Peptide B 38,7 61,3 1,58 24,68
Peptide B 38,5 61,5 1,60 25,32
Peptide B 39,3 60,7 1,54 22,76
PBS NT contrôle 47,4 52,6 1,11
Pep Un contrôle NT 49,4 50,6 1,02
Pep B NT contrôle 45,6 54,4 1,19

Tableau 1. Analyse des données représentatives. "NT" est non-transfert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

Ce dosage peut être modifié pour enquêter sur la capacité proliférative des cellules, y compris l'expansion clonale, parce CFSE divise de façon relativement égale parmi les descendants 10,11. Il est également possible d'utiliser l'étiquetage CFSE pour enquêter 6,12 migration cellulaire, mais il existe d'autres cellules de traçage des méthodes qui peuvent être plus appropriés en fonction de votre hypothèse, pour les tétramères exemple et bioluminescence 13, qui peut également être combiné avec l'étiquetage CFSE.

Il est important de noter que saigne CFSE plus dans des canaux multiples sur le cytomètre en flux, donc si vous souhaitez co-taches pour un marqueur de surface, PeCy7 serait un bon choix de fluorophore, tandis que PE ne pourrait pas fonctionner aussi bien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

Aucun conflit d'intérêt déclaré. Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) à l'Université de Wisconsin-Madison.

Acknowledgements: Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

Je tiens à remercier Bianca Mothe, Carla Oseroff, et Marie-France DelGuercio pour me présenter à des tests immunologiques et de manipulation de la souris. Le travail dans le laboratoire de GA Splitter est financé par les NIH-RO1 subvention de 1-AI-073 558, GLRCE subvention de 1-U54-AI-057 153, et Bard US-3829-06.

Materials: Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

Name Company Catalog Number Comments
1 mm glass beads Biospec Products 11079110
70 µm cell strainer BD Biosciences 352350
96-well plate Costar 3799
Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant Pacific Immunology n/a
DMSO Sigma-Aldrich D-5879
FBS GIBCO, by Life Technologies 16000-077
FC 500 Flow Cytometer Beckman Coulter Inc. n/a
Kontes glass tissue grinder Kontes Corp 885300-0015
Mini Beadbeater Biospec Products n/a
Needle BD Biosciences 305175
Parafilm "M" Pechiney Plastic Packaging PM992
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8
PBS GIBCO, by Life Technologies 10010-023
PharmLyse lysing reagent BD Biosciences 555899
RPMI 1640 GIBCO, by Life Technologies 11875-093
Syringe BD Biosciences 309602
Vybrant CFSE Kit Invitrogen V12883

References: Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

  1. Blattman, J.N., Wherry, E.J., Ha, S.J., van der Most, R.G., & Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol 83 (9), 4386-4394 (2009).
  2. Jenkins, M.R., Tsun, A., Stinchcombe, J.C., & Griffiths, G.M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity 31 (4), 621-631 (2009).
  3. Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol 380, 365-376 (2007).
  4. Durward, M.A., Harms, J., Magnani, D.M., Eskra, L., & Splitter, G.A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun 78 (1), 168-176.
  5. Lyons, A.B., & Parish, C.R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods 171 (1), 131-137 (1994).
  6. Weston, S.A., & Parish, C.R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods 133 (1), 87-97 (1990).
  7. Kim, P.S. & Ahmed, R. Features of responding T cells in cancer and chronic infection. Curr Opin Immunol 22 (2), 223-230.
  8. Takamura, S., et al. Premature Terminal Exhaustion of Friend Virus-Specific Effector CD8+ T Cells by Rapid Induction of Multiple Inhibitory Receptors. J Immunol.
  9. Flesch, I.E., et al. Altered CD8(+) T cell immunodominance after vaccinia virus infection and the naive repertoire in inbred and F(1) mice. J Immunol 184 (1), 45-55.
  10. Akondy, R.S., et al. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol 183 (12), 7919-7930 (2009).
  11. Wallace, P.K., et al. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A 73 (11), 1019-1034 (2008).
  12. Labadi, A., & Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol 21 (9), 1047-1056 (2009).
  13. Suffner, J., et al. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol 184 (4), 1810-1820.

Ask the Author: Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter