In vivo Near Infrared fluorescência de imagem intravascular (NIRF) Molecular da placa inflamatória, uma Abordagem Multimodal para imagem da Aterosclerose

In vivo Modelo Animal: Geração da Aterosclerose Experimental aortoilíaca

1) Linha de Base e Angiografia Denudation Balloon

1. Antes da obtenção de linha de base angiografia e desnudação do balão, uma Nova Zelândia coelho branco é alimentado um colesterol elevado (1%) dieta por uma semana. Este animal é utilizado para a relevância de translação como: 1) os vasos aorto-ilíacas de coelhos são mesmo calibre de artérias coronárias humanas (2,5 3,5 mm) e 2) a hiperlipidemia, o modelo de balão de lesão gera aterosclerose inflamado tendo similares células inflamatórias (macrófagos ) e moléculas (catepsinas) como na aterosclerose humana.
2. Após a alimentação de colesterol, o animal é anestesiado com propofol e cetamina. A one-inch incisão cervical mediana ventral é feita usando usando um tamanho de 15 lâmina de bisturi. Usando técnicas de dissecção romba, os músculos debaixo da fáscia no lado direito da traquéia está exposto. O músculo sternocephalicus esquerdo é separado ao longo de sua junção do tecido conjuntivo, ea artéria carótida comum direita é exposta. A artéria é separado do nervo vago. Loops de sutura proximal e distal são colocados sobre a artéria para permitir a retração e oclusão. A 1 a 2mm chanfrado arteriotomia é feita através das quais a 5 (diâmetro externo 1,67 milímetros) Francês bainha vascular é inserido e heparina (1000μ/mL, ~ 150units/kg) é administrado via intra-arterial da bainha.
3. Corante de contraste (Ultravist) é então injetada (1 a 2 mL) durante um período de 2 segundos para obter um angiograma controle da aorta distal e ambas as artérias ilíacas.
4. As artérias femoral e aorta são, então, ferido por desnudação endotelial. Usando métodos padrão fluoroscopia, um cateter de embolectomia 3FR Fogarty é colocado na artéria femoral distal e inflado com 0,3 a 0,5 cc de contraste (50% contrast/50% salina) ou ar. O cateter é então retirado proximalmente em seu estado inflado uma distância ao longo da ilíaca direita e aorta distal até o take-off da artéria renal. Após a desnudação do balão, a angiografia é repetido para documentar a permeabilidade do vaso. Após a angiografia, todos os cateteres e bainhas são removidos ea artéria carótida proximal direito comum é ligada, o músculo e fáscia são suturada com fio de 4 / 0 absorvível, ea incisão na pele fechada com um 4 / 0 de sutura não absorvível.
5. O animal é então autorizado a recuperar com a administração de um antibiótico de dose (cefazolina, 0,5 gramas IM). Medicamentos para a dor, incluindo 0,01 mg / kg IM de buprenorfina (duas vezes por dia, conforme necessário). Os animais são então continuou sobre o colesterol 1% para 4 semanas desnudação pós-balão. Na semana 5, os animais são a transição para dieta de colesterol 0,3%.

Imagens Multi-modal integrado de coelho ateromatosas

2 Labeling) de proteoliticamente ativa placa inflamado usando nanosensor injetável; angiografia, ultra-som intravascular (IVUS), e in vivo intravascular NIRF imagem do coelho ateroma

1. Oito semanas após a lesão por balão e 24 horas antes da imagem, o coelho é injetado com intravenosa 500 nmol / kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) pela veia da orelha.
2. Vinte e quatro horas após a injeção, os animais são anestesiados e acesso arterial é obtida através da artéria carótida comum esquerda (veja o passo 1.2). Intra-arterial de heparina é administrada (150 unidades / kg). Linha de base é obtida como a angiografia acima.
3. Um cateter ultra-som intravascular é carregado em um clínica da artéria coronária 0.014 capaz polegadas e inserido na bainha. Usando orientação fluoroscópica, a ponta do fio radiopaco está posicionado distalmente na artéria ilíaca direita. O cateter ultra-som intravascular é então avançado para a artéria ilíaca proximal usando um padrão de técnica monorail clínico.
4. A retirada de 100 mm é iniciado e as imagens são gravadas. Reconstrução longitudinal da embarcação é obtida e placa luminal é identificado.
5. O cateter NIRF ^11,12 é carregado no fio de 0,014 polegadas (monorail do sistema), eo cateter é cuidadosamente inserido na bainha e cabeça de imagens está posicionado distalmente em artéria ilíaca direita.
6. Múltiplas pullbacks automatizado (1 mm / seg pullback longitudinal, 30 tiros por minuto) são realizadas e os sinais de fluorescência dentro das zonas de aterosclerose são anotados. As imagens são gravadas e posterior processamento, com escala adequada e janelas com o alcance do sinal é alcançado.

Eutanásia 3) e isolamento de ex vivo de tecido aorto-ilíaca

1. A eutanásia é realizada com 1cc de agente de eutanásia (390mg de sódio solução de pentobarbital sódico fenitoína e 50 mg), injeção, intravenosa única.
2. A árvore arterial é perfundido com solução salina 0,9% até a veia cava inferior é claro de sangue. As artérias aorta e ilíaca aterosclerótica são identificadas e dissecadas livre dos tecidos circundantes. Além disso, pequenos pedaços 2 x 2 cm de liver, rins, baço e coração também são obtidos.
3. Ex vivo NIRF imagem com o cateter intravascular imagem NIRF pode ser feito nesta fase. O navio é alongado eo cateter NIRF é re-inserido na aorta proximal até que a cabeça de imagem é posicionada na artéria ilíaca direita ou bifurcação. Múltiplas pullbacks automatizados são realizados como descrito acima (ver 2.6).

4) Ex vivo de fluorescência Reflectância Imaging (FRI) da aorta dissecada e artérias ilíacas

1. Tecidos dissecados é colocado em 10-20 cc de soro fisiológico e transportados para análises sex (Imagem Kodak Estação 4000mm Pro, Carestream Health, Inc.).
2. Vasos aorta, ilíacas são alongadas para aproximar tempo real comprimentos e as imagens são obtidas em vários comprimentos de onda [luz branca, o canal verde fluorescente (ex 495 nm, empregando 515 nm), Cy5 (ex 565 nm, empregando 670 nm) e Cy7 (ex 650 nm, empregando 760 nm)] canais. Uma série de tempos de exposição são utilizados para cada comprimento de onda (0.1-30s) e imagens adquiridas são exportados como DICOM ou 16 bits TIFF arquivos fora de escala para análises posteriores. Como controles positivos e negativos, os órgãos (fígado, baço, rim e coração) são gravadas em canais similares e tempos de exposição.
3. Áreas de sinal aumentado no canal infravermelho próximo (780nm +) são anotadas nas artérias ateroscleróticas.

5) Incorporação de tecido para análise de corte e imuno-histoquímico

1. Áreas de normal (sem lesão tecidual; artéria ilíaca ou seja, à esquerda) e áreas de placa são identificados e pequenos anéis de 5-10 mm de tecido são incorporados em outubro (Temperatura ideal de corte) de mídia. Blocos são armazenadas a -80 C até o corte.
2. Técnicas padronizadas para análises de corte e imuno-histoquímica são executadas. Hematoxilina e eosina, Ram-11 e catepsina B coloração são executadas.

Análise e Integração de multi-modal Imagens (angiografia, IVUS, NIRF e sex.)

6) Processamento de imagens NIRF e sex.

1. Arquivos DICOM que contém dados de imagem de NIRF e sex (tomadas no canal infravermelho próximo nm 780) pullbacks são processados ​​usando MATLAB e software OsiriX, respectivamente. Janelas adequado para mostrar gama completa de intensidade do sinal é alcançado. Imagens finais são exportados como arquivos TIFF.
2. Os arquivos são importados para o software de processamento de imagem padrão (Keynote pode ser usado). As imagens são alinhadas com base em pontos de referência (ou seja, vértebras na angiografia, bifurcação ilíaca, e da artéria renal). Áreas de navio normal e placa são identificados.
3. Regiões de interesse (ROI) são manualmente traçado (para tecido normal e áreas de placa) e média intensidades de sinal são adquiridos por meio OsiriX e MATLAB, respectivamente, para ambos os sex e imagens NIRF. Para orientar o rastreio adequado, a imagem longitudinal IVUS do navio é usado e identificação da embarcação normal e placa são facilmente identificados.
4. Alvo de fundo (TBR) rácios são calculados para as zonas de placa.

Resultados representativos:

Após a conclusão do protocolo acima, podemos identificar e caracterizar as áreas de atividade aumentada protease catepsina na placa inflamatória dentro da aorta e vasos ilíacos. Injeção de um nanosensor ativável (Prosense/VM110) nos permite identificar a placa proteoliticamente ativo. Estes aparecem como sinal luminoso ou zonas de intenso quando fotografada usando sex no canal infravermelho próximo (750 nm). O pullbacks NIRF se correlacionam com a intensidade de sinal aumentado em sex e alinhamentos com IVUS que permitem o registo de sinais anatômicos NIRF. TBR placa calculados, obtidos a partir de sex e NIRF foram semelhantes (ver Figura 3: média NIRF TBR 4.2, significa sex TBR 2.9). Análise imuno-histoquímica de placa luminosa confirma presença intensa de RAM-11 e atividade catepsina B em áreas de placa (dados não mostrados).

Figura 1. Esquemática de 2D Cateter NIRF Para ampliar o potencial clínico de uma abordagem 1D sensoriamento NIRF ^6, construímos um romance 2-D NIRF cateter para imagens intravascular. ^11,12 cateter A custom-built consiste em uma fibra óptica (125 mícron de diâmetro alojada em tubos de polietileno: 2.9F) que ilumina usando uma fonte de excitação 750 nm laser. Luz laser é emitido em um ângulo de 90 graus em relação ao eixo da fibra. O sistema utiliza dois motores automatizados (rotação e translação) para permitir a imagem grau concomitante 360 ​​e recuo longitudinal para a obtenção de imagens 2D verdade. Imagens usadas com permissão da referência 11.

Figura 2. Esquemático demonstrando a ativação da protease mediada do nanosensor, Prosense/VM110. Imagem usada com permissão da referência 10.

Figura 3. In vivo e ex vivo TBRs placa (alvo de relações de fundo)

Inflamado placas de alto risco ou vulneráveis ​​são provavelmente responsáveis ​​para a maioria dos infartos do miocárdio. A identificação das placas, antes da aparecimento dos sintomas tem importantes implicações clínicas tanto na previsão de resultados e orientar a terapia médica. Convencionais coronária arterial modalidades de imagem, como raio-x angiografia geralmente se concentram na caracterização dos estreitamentos luminais ao invés de iluminar os perfis biológicos subjacentes de alto risco, geralmente não-estenóticas lesões. Intravascular NIRF molecular imaging oferece uma abordagem de laboratório cateterismo cardíaco traduzíveis que incorpora a biologia de inflamação placa utilizando nanosensores que identificam macrófagos ativos dentro da placa, uma marca de celular de uma placa inflamado propensos à ruptura. ⁹

O protocolo a seguir descrito acima utiliza uma abordagem integradora multimodal combinando angiografia, IVUS e NIRF imagens para identificar placas inflamadas. Este romance 2D cateter NIRF capitaliza sobre as propriedades ópticas favoráveis ​​da largura de banda do infravermelho próximo de fluorescência para detectar assinaturas moleculares através do sangue, e é uma promissora abordagem in vivo a imagem molecular. O Prosense/VM110 nanosensor é acoplado a fluorocromos que emitem fluroescence em 780 nm e utilizar auto-extinguindo, na ausência de clivagem proteolítica ou ativação pela enzima catepsina B (altamente expressa em macrófagos residentes). Na detecção de sinal de fluorescência vivo pelo cateter NIRF permite a identificação de macrófagos carregados de placa (TBR 2.9). O uso de ex vivo de fluorescência de reflectância de imagem (FRI) confirma a presença de NIR sinal de fluorescência dentro das áreas de placa (TBR 4.2). Coloração imuno-histoquímica de RAM-11 e catepsina dentro das áreas de placa confirmar a intensa infiltração de macrófagos catepsina-B positivo (dados não mostrados).

A incorporação de IVUS e sinal NIRF podem ser fundidas a intensidade do sinal mapa dentro de placa visível ao longo do comprimento da embarcação (dados não mostrados) e oferece uma oportunidade única para elucidar melhor a morfologia da placa luminal e conteúdo de macrófagos. Limitações atuais da técnica acima incluem a incapacidade de exatamente co-registrar o IVUS e pullbacks NIRF. Retirada simultânea através de um cateter duplo-modal integrado aumentaria a precisão da localização do sinal e, potencialmente, permitir a resolução da localização do sinal dentro da parede dos vasos (ou seja, profundidade de sinal dentro do lúmen, mídia ou adventícia). Dupla modal NIRF / IVUS ou NIRF / tomografia de coerência óptica cateteres (OCT) de fusão são antecipados, portanto, uma melhor definição, de sinal e incorporam a arquitetura de placa com a biologia.