El uso de diacetato de carboxifluoresceína Ester succinimidil (CFSE) para controlar la proliferación de linfocitos

Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259, doi:10.3791/2259 (2010).

Carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE) es un medio eficaz y popular para controlar la división de linfocitos ^1-3. CFSE etiquetas covalentemente moléculas de larga vida intracelular con el colorante fluorescente, carboxifluoresceína. Por lo tanto, cuando una célula se divide CFSE marcado, todos sus descendientes están dotados de la mitad del número de carboxifluoresceína etiquetados con las moléculas y por lo tanto cada división celular se puede evaluar midiendo la correspondiente disminución de la fluorescencia celular mediante citometría de flujo. La capacidad de la CFSE para etiquetar las poblaciones de linfocitos, con una alta intensidad de fluorescencia de la varianza excepcionalmente bajo, unido a su baja toxicidad celular, lo convierten en un medio de contraste ideal para medir la división celular. Ya que es un colorante de fluoresceína basado también es compatible con una amplia gama de fluorocromos otros por lo que es aplicable a la citometría de flujo multi-color. En este artículo se describen los procedimientos normalmente utilizados para el etiquetado de linfocitos de ratón con el propósito de monitorear hasta ocho divisiones celulares. Estas células marcadas se pueden utilizar tanto para la in vitro e in vivo.

1) El reactivo de configuración

1.1) CFSE solución madre

El tinte CFSE se compra como diacetato de carboxifluoresceína éster de succinimidilo (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mol), por lo general en viales de 25 mg. Disolver la dosis de 25 mg en 8,96 ml de DMSO para una solución de reserva final de 5 mM (50-100 almacenar alícuotas a -20 ° C durante varios meses). CFDA, SE va a reaccionar con una solución acuosa por lo que es fundamental que dicha exposición evitarse durante el almacenamiento.

1.2) Los linfocitos

Aislar linfocitos de bazo y los ganglios linfáticos o de los ratones y resuspender en 1 ml de medio de cultivo (por ejemplo RPMI) con 5% inactivado por calor (HI) de suero fetal bovino (FCS), con una concentración celular de 0,5 x ¹⁰ 06 al 10 x 10 ⁷ / ml.

2) CFSE etiquetado

2.1) de rutina método:

1. Bien volver a suspender las células en el volumen de 1 ml de medio y colocar cuidadosamente en el fondo de un fresco (no mojado) tubo cónico de 10 ml.
2. Coloque el tubo en posición horizontal (utilizando un tubo que no impedirá que el contacto con el medio 1 ml de células de suspensión de movimiento y mezcla antes de tiempo con el CFDA soluciones, SE).
3. Añadir con cuidado 110 l de PBS a la porción no-en contacto con el plástico en la parte superior del tubo de modo que no pueda hacer contacto con la solución de células.
4. Resuspender 1,1 l de la población de 5 mm de CFDA, SE en el PBS 110 mL.
5. Rápidamente tapar el tubo e invierta y agite bien para conseguir uniformes rápida mezcla de las soluciones. Tenga en cuenta que el tinte CFSE se encuentra en una concentración final de 5 mM, sin embargo, la concentración óptima puede tener que ser determinado para cada lote preparado, y luego cada 6 meses para asegurar que sea efectivo.
6. Se incuban las células durante 5 minutos a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que la conversión de la CFDA, SE CFSE (véase la discusión) se convierte en el tinte fluorescente y por tanto, susceptibles de alterarse por la exposición excesiva a la luz. Por lo tanto, es recomendable proteger el tubo de la luz a partir de ahora, por ejemplo, cubriéndola con papel de aluminio.
7. Lavar las células mediante la dilución en 10 volúmenes de 20 ° C PBS con 5% FCS HI, sedimentación por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 20 º C y desechar el sobrenadante. Repetir el lavado dos veces más.

2.2) Método alternativo, que también es apropiado para el número de células más alta (10 - 30 x 10 ^7):

1. Preparar un 2 x (10 M) CFDA, la solución de la SE por la adición de 2 l de la población de 5 mM a 1 ml de PBS y añadir rápidamente esta a 1 ml de células resuspendidas a fondo, y rápidamente se tapa el tubo e invierta y agite bien para conseguir uniforme de la mezcla rápida.
2. Se incuban las células durante 5 minutos a temperatura ambiente y se lava como en los pasos 2.1 (f) y 2.1 (g).

2.3) Las células se pueden aplicar a un protocolo de interés para la inducción de la división celular. Células marcadas se pueden utilizar en los estudios in vitro y en ensayos in vivo.

2.4) A la finalización del ensayo de proliferación, las células se recogen y se analizan por citometría de flujo (ver más abajo para los ejemplos representativos).

3) Resultados de Representante

Para evaluar la proliferación de linfocitos por dilución CFSE, es útil conocer la fluorescencia de las células indivisas (es decir, el máximo de fluorescencia) y no marcado células (fluorescencia es decir, como mínimo). Por lo tanto, el diseño experimental debe tomar en cuenta estos controles. A continuación se muestran ejemplos de ensayos in vitro y en ensayos in vivo utilizando CFSE para medir CD8 + división de las células T por citometría de flujo.

3.1) En la estimulación in vitro

La figura 1 muestra los perfiles de los CFSE CFSE marcado con ovoalbúmina (OVA) específicos de las células T CD8 + receptor transgénicos OT-I las células T después de la cultura 3 días con células dendríticas pulsadas con diversas cantidades de OVA. Células T CD8 + purificados de los ganglios linfáticos y el bazo de los ratones OT-I fueron marcadas con CFSE y 1 x 10 ⁵ células en cultivo con 3,3 x 10 ⁴ DC. DC, donde pulsada con OVA durante 1 hora a 37 º C y lavado dos veces antes de la cultura. Después de 3 días, las células donde se cosechan y se marcaron con anti-CD8-APC anticuerpos y Hoechst 33258 y luego analizadas por citometría de flujo (50.000 eventos recopilados). Live (Hoechst 33258 -) las células CD8 + se muestran. Como los controles, las células CD8 + T cultivadas solas, muestra la intensidad de la CFSE no dividen las células, mientras que las células no llevan la etiqueta muestra la autofluorescencia de las células y los límites de las divisiones celulares detectables. Tenga en cuenta que cuatro picos CFSE se puede ver en cada uno de los paneles en este ejemplo, lo que indica que las células han sido sometidos a un máximo de 3 divisiones.

3.2) En la estimulación in vivo

La figura 2 muestra los perfiles de la CFSE CFSE marcado con OVA-específico de los receptores de células T CD8 + transgénicos OT-I las células T después de 3 días en vivo in la presencia de OVA 20 mg. Células T CD8 + purificados de los ganglios linfáticos y el bazo de CD45.1 congenic OT-I ratones fueron marcadas con CFSE y 5 x 10 ⁶ células inyectadas iv en la vena lateral de la cola de C56BL/6J (CD45.2 +) ratones. Después de 2 horas los ratones fueron inyectados iv con 20 mg de OVA. Después de 3 días, el bazo de los ratones han sido recogidos, hecho en una única suspensión de células, etiquetados con anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 y anti-CD45.1-PE-Cy7 anticuerpos y Hoechst 33258 y se analizan por citometría de flujo (1.000.000 sucesos recogidos). Live (Hoechst 33258 -) B220-las células se muestran en el panel de la izquierda y cerrado CD8 + células CD45.1 + muestra en el panel derecho. Como controles, sin estimular CFSE marcado con células T CD8 +, muestra la intensidad de la CFSE no dividen las células, mientras que los no etiquetados células muestra la autofluorescencia de las células y los límites de las divisiones celulares detectables. Tenga en cuenta que el uso de la diferencia CD45 alotípicos es vital en la resolución del transferido células T CD8 + de acogida, ya que son un subconjunto menor de edad del total de células T CD8 + (panel izquierdo). Tenga en cuenta que la mayoría de las células caen dentro de los 7 picos CFSE en este ejemplo (panel derecho), lo que indica que las células han sido sometidos a un máximo de 6 divisiones.

Figura 1. Capacidad de los CFSE marcado con ovoalbúmina (OVA) específicos de las células T del receptor de transgénicos CD8 + OT-I las células T para responder in vitro para DC pulsado con diferentes concentraciones de OVA, los datos muestran que después de 3 días de cultivo. Tenga en cuenta que no divide la población de linfocitos T CD8 + las células en ausencia de antígeno (la luz histograma gris) y auto-fluorescencia de la población no etiquetados (histograma de color gris oscuro). La figura muestra células T CD8 + que han dividido a 1-3 veces sobre la base de los picos de dilución CFSE, constituido por células T que divide a las concentraciones de antígeno superior.

Figura 2. Capacidad de los CFSE marcado con ovoalbúmina (OVA) específicos de las células T del receptor de transgénicos CD8 + OT-I las células T, cuando adoptively transferido en ratones C57BL / 6 para responder a OVA, datos que se muestran tres días después de la transferencia adoptiva Panel izquierdo:. CD8 +, CD45. 1 + OT-1 de células T en ratones receptores. Panel de la derecha: el perfil de CFSE proliferación. Tenga en cuenta que no divide la población de células T CD8 + en los ratones receptores no reciben el antígeno (la luz histograma gris) y auto-fluorescencia de los no etiquetados linfocitos (histograma de color gris oscuro). La figura muestra las células CD8 + T que han dividido a 1.6 veces sobre la base de los picos de dilución CFSE.

Figura 3. Una representación de los diversos eventos moleculares que ocurren durante el etiquetado de las células de diacetato de carboxifluoresceína éster de succinimidilo (CFDA, SE). Para más detalles sobre el proceso de ver el texto de discusión. Nota: "CFSE" El acrónimo genérico, no CFDA, SE, se utiliza para describir el reactivo de marcaje y el procedimiento de etiquetado en general. Figura basada en la parroquia ^4.

Con el fin de apreciar cómo funciona y por qué CFSE etiquetado uniforme, rápido se requiere para su uso en el análisis de la proliferación, es útil para entender la base molecular de la CFSE etiquetado de la célula. Esto puede ser dividido en dos fases, 1) entrada de celda y 2) el etiquetado de proteínas (Figura 3). 1) entrada a la célula: la entrada del colorante en la célula es mediado por la forma diacetilados del colorante, diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFDA, SE). Los acetatos que el colorante permeable membrana que permite su flujo muy rápido a través de la membrana plasmática. Esterasas, presentes en la célula, unirá los acetatos de CFDA, SE y por lo tanto dar lugar a la forma de la CFSE tinte que es mucho menos permeable la membrana, lo que se concentra el medio de contraste dentro de la célula. 2) El etiquetado de proteínas: Mientras tanto CFDA, SE y CFSE han amino-reactiva cadenas laterales succinimidilo, sólo la CFSE es fluorescente. La alta concentración intracelular de la CFSE facilita el etiquetado rápido y de alto nivel intracelular de proteínas. CFSE etiquetado de las células debe realizarse rápidamente a fin de obtener una población homogénea de células etiquetadas, lo cual es fundamental para la resolución de las células que han sufrido varias divisiones como se muestra en los resultados representativos (Figura 1 y 2).

No hay conflictos de interés declarado.

El trabajo presentado en este artículo fue apoyado por un Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica (NHMRC) de Australia Grant Program (CRP) y un proyecto NHMRC Grant (CRP y BJCQ). También BJCQ es un NHMRC Peter Doherty Postdoctoral Fellow.

1. Lyons, A. B. & Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods 171, 131-137 (1994).
2. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., & Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al. Chapter 4, Unit 4 9 (2009).
3. Quah, B. J., Warren, H. S., & Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols 2, 2049-2056 (2007).
4. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol 77, 499-508 (1999).

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