The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (5), e226, doi:10.3791/226 (2007).
이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화를 만들기위한 절차를 설명합니다. 표백제를 사용하는 배아하고 dechorionation를 수집하기 위해 방법은 증명하고 있습니다. 입 흡입 튜브에 부착된 유리 pipet을 사용하여, 우리는 하나의 배아에서 세포의 제거를 보여줍니다. uncoated 유리 coverslip에 대한 매체의 작은 (5 L) 드롭으로 각 embyro에서 세포를 분산하는 방법을 시연합니다. 도금 후 1 시간에 현미경을 통해보기 원하는 세포 밀도를 보여줍니다. 정의 매체 자라면 생존 세포의 대부분은 12-24시간로 neuritic 프로세스를 확장하기 전에 문화를 한 번 이상 나누어 neuroblasts 있습니다. 현미경을 통해 볼 수 neurite 가지의 수준을 보여줍니다과 체외에서 이일에 건강한 문화의 예상 분기. 문화가 22-24 ° C.에서 5 % CO 2 배양기에서 정의된 매체를 기반으로 간단한 중탄산염에서 재배 Neuritic 프로세스는 문화의 첫 번째 주 동안 정교한 계속하고 그들은 종종 기능 시냅스 연결을 형성 인접 세포에서 neurites과 접촉을 때. 이러한 문화의 뉴런 전압 - 게이 티드 나트륨, 칼슘, 그리고 칼륨 채널을 표현하고 전기 고르기가 있습니다. 이 문화 시스템의 연결을 차별화, 흥분, 그리고 버렸네 형성 / 기능을 조절 분자 유전과 환경 요인을 공부하는 데 유용합니다.
I. Drosophila의 배아 컬렉션
II. 블리치와 함께 배아 Dechorionation
III. 단일 배아 문화의 준비
IV. 문화를 성장을위한 DDM1 정의 매체
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midgastrula 스테이지 배아에서 준비 Drosophila 문화에서 뉴런은 체외에서 분화하기 전에 분할 많은 중 neuroblast의 엽 성의 전구 물질에서 발생. 이 시스템의 연결을 따라서 개발의 매우 초기 단계 (로보어 외., 2003)에서 중요한 유전과 환경 요인의 탐험에 대한 독특한 기회를 제공합니다. 우리는 간단한 정의 매체 성장 뉴런도 (; 리 O 다우드, 1999 O 다우드, 1995) 기능 시냅스 연결을 형성 전기 고르기 뉴런으로 차별화하는 것으로 나타났습니다. .이 모델 시스템은 전기 흥분과 시냅스 전송 (하지스 외, 2002 년 개발에 관련된 역할 유전자와 환경 요인을 탐구하는 데 사용할 수있는 표준 전체 세포 녹음 기술과 함께, 돌연변이 및 / 또는 약리 조작의 분석을 사용하여, 리 그리고 O 다우드, 2000; 리 외, 2003)..
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이 작품은 DKOD에 NIH 부여 NS27501에 의해 지원되었다. HHMI 교수 부여에서 DKOD이 작업에 대한 추가 지원합니다.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
| Transferrin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
| Petri dishes | ||||
| Cover-slips | Bellco Glass | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
| Paper filter | Whatman, GE Healthcare | #1 | ||
| 10cc syringe | Tool | |||
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media. |
||||
1. Rohrbough, J., O'Dowd, D.K., Baines, R.A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54: 254-271 (2003)
2. O'Dowd, D.K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27: 113-126 (1995)
3. Lee, D. O'Dowd, D.K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19: 5311-5321 (1999)
4. Lee, D. O'Dowd, D.K. Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce. J. Neurosci. 20: 2104-2111 (2000)
5. Hodges, D.D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C.F., Hall, L.M. O'Dowd, D.K. tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons. Mol. Cell Neurosci. 19: 402-416 (2002)
6. Lee, D, H. Su, O Dowd, D.K. GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons. J. Neurosci. 23: 4625-4634 (2003).
