Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

I. de colheita de embriões Drosophila

1. Prepare pratos de coleta de ovos
   1. Ferva 200 ml dH ₂ O com 8 g de agar
   2. Arrefecer a 50 ° C
   3. Adicionar 2 ml EtOH e 2 ml de ácido acético
   4. Despeje em 35 milímetros petri pratos de plástico, tops
   5. Esfriar e guarde em recipiente apertado do ar a 4 ° C
   6. Faz cerca de 80 placas
2. Prepare colar Yeast
   1. Dissolver o fermento Fleishmans ativa fermento em água para formar colar
   2. Microondas por 20-30 segundos para matar levedura (atente para ferver mais)
   3. Loja em seringa de 10 cc (sem agulha) a 4 ° C por 2 semanas
3. Moscas: Os adultos utilizados para a coleta de ovos são geralmente mais produtiva entre 3 e 14 dias depois de sair, desde que tenham tido acesso a alimentos frescos. Muitas ações têm mutante diminuição da fertilidade, que pode se manifestar de uma taxa reduzida de postura de ovos e uma mudança na idade em que eles são mais produtivos. Geralmente, várias centenas de adultos fazem para uma população postura boa.
4. Procedimento: Espalhe uma camada fina de pasta de levedura em uma placa de coleta de ovos. Isto fornece um substrato favorável para a postura dos ovos. Adulto transferência voa para uma garrafa limpa ovo recolha e tape o prato de coleta para a boca da garrafa. Não deixe as moscas nessas garrafas mais do que 3-4 horas como a umidade aumenta e as moscas ficam presas na pasta e nas laterais do frasco.

II. Dechorionation embrião com Bleach

1. Criar um funil de Buchner ligado a um frasco de filtro ligado a um aspirador. Coloque um pedaço de papel Whatman # 1 no funil. Com sucção em execução, molhe o papel com água destilada estéril.
2. Enxágüe embriões a partir de chapas para a coleta de papel de filtro com uma corrente de água de uma garrafa de lavagem.
3. Lave-os em vários volumes de água estéril, desligue aspirador, em seguida, adicionar um volume funil de água sanitária a 50%. Deixe os ovos sentar 5-10 minutos. O córions será dissolvido em 1-2 minutos, mas quanto mais tempo você deixar os embriões no bleach mais da levedura contaminante será destruída. Escolher os adultos e as larvas que têm lavado prato.
4. Enxágüe os embriões em uma placa de Petri estéreis (NÃO cultura de tecidos) com água destilada estéril. Muitos dos embriões grude no fundo do prato, se não tiver sido pré-molhada. Enxaguar várias vezes com água estéril neste prato.
5. Examine os embriões com luz transmitida para escolher embriões meados de gástrula palco.

III. Preparação de culturas único embrião

1. Faça DDM1 (ver receitas na seção IV)
2. Derramar água fora prato de embriões pouco antes de cultivo. Cobrir embriões com meios estéreis.
3. Conjunto com 3, 35 pratos de petri milímetros. Coloque em 4 autoclavado lamínulas redondas em cada prato. Em cada lamela, colocar 5 mL de meio. Use Bellco lamínulas de baixa coverlips vidro de chumbo.
   
   Bellco Biológica Copos
   800-257-7043
   Cat # 1943-00012
   
   
4. Puxar alguns pipetas razoavelmente bem. O pipetas que usamos são puxados em um extrator Narishige PP-83. As dimensões exatas da pipeta não são cruciais e que geralmente puxá-los mais finos do que queremos e eles quebram a ponta no mesmo campo de visão como o embrião para medir o tamanho. Você não quer para sugar todos os embriões de uma só vez, e seu não quer a ponta tão pequena que leva 5 minutos para sugar as células. Apontar para algures no meio. Examine os embriões com luz transmitida e usar um tubo de sucção da boca ligado ao pipeta para remover o conteúdo do embrião. Dispersar as células para a lamínula cuidadosamente preparado por expelir as células tão perto da lamela possível. Você pode querer examinar as lamelas com maior poder e mais dispersar as células da mesma maneira.
5. Permitir que as células sentar-se por não mais que 10 minutos. Flood o prato com a mídia e colocar em incubadora, de 4-5% CO ₂ ambiente, se estiver usando meio definido. Temperatura entre 22-24 ° C. Rotineiramente use 23 ° C e umidade de 95%. Umidade é importante, como você quiser evitar a evaporação. Você pode usar uma incubadora de padrão de mamíferos colocado em uma das câmaras frias com controle de temperatura definida para 23 ° C.

IV. DDM1 meio definido para o cultivo das culturas

1. Faça DMEM: Para 100 mls de F12/DME Ham Media (DMEM) (Irvine Scientific # 9052).
   1. Adicionar 0,476 g Hepes (20mM) (Sigma # H-3375). Mix.
   2. Adicionar 1,25 ml L-Glutamina 200 mM (Irvine Scientific # 9317). Mix.
   3. Filtro na capa com 0,2 m de acetato de seringa filtro (precisa de 2 filtros).
   4. O pH é 6,64 e Osm 288.
   5. Faça alíquotas de 10ml em tubos de centrífuga de 15ml.
   6. Armazenar a 4 ° C por não mais de 2 semanas.
      
      Nota: Utilize sempre água filtrada e fazer autoclavado em recipientes que são reservados para Mídia e suplementos apenas. Nunca coloque um eletrodo de pH ou agitar bar utilizado para outros fins em Media.To fazer DDM1: suplementos Adicionar listados abaixopara DMEM pouco antes de cultivo.
      
      
2. A 10 ml de DMEM acrescentar:
   • 100 mL Transferrina
   • 100 mL Putrescine
   • 100 mL Selenium
   • 100 mL de progesterona
   • 50 mL de insulina

Em culturas de Drosophila preparados a partir de embriões em estágio midgastrula os neurônios surgem a partir de precursores neuroblastos, muitos dos quais divide antes de diferenciação in vitro. Este sistema, portanto, proporciona uma oportunidade única para a exploração de fatores genéticos e ambientais importantes em fases muito iniciais de desenvolvimento neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Nós temos mostrado que os neurônios cultivados em um meio simples definida diferenciar em neurônios eletricamente excitáveis ​​que também forma funcional conexões sinápticas (O Dowd, 1995; Lee e O Dowd, 1999). Usando análise de mutantes e / ou manipulação farmacológica, em combinação com as técnicas de células inteiras gravação deste sistema modelo pode ser usado para explorar o papel genes e fatores ambientais envolvidos no desenvolvimento da excitabilidade elétrica e transmissão sináptica (Hodges et al, 2002;. Lee e O Dowd, 2000; Lee et al, 2003)..