Methyltransferases की रूपरेखा और अन्य एस Adenosyl _{एल homocysteine ​​बाध्यकारी प्रोटीन}

Lenz, T., Poot, P., Gräbner, O., Glinski, M., Weinhold, E., Dreger, M., et al. Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-_L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J. Vis. Exp. (46), e2264, doi:10.3791/2264 (2010).

1) ई की तैयारी कोलाई DH5α सेल lysate

1. ई. के साथ एक 2ml संस्कृति टीका लगाना (एक टेस्ट ट्यूब में लेग मीडिया) एक ग्लिसरॉल शेयर और सेते से कोलाई DH5α सीधे 37 पर तनाव डिग्री सेल्सियस और 8 एच. के लिए 250 rpm Autoclaved लेग मीडिया (10 छ / एल Bacto - tryptone, 5 छ / एल खमीर निकालें, 10 छ / एल, NaCl 7.5 पीएच) का उपयोग करें.
2. 2 एमएल और रात खत्म संस्कृति सेते के साथ 37 पर चकरा के साथ एक 1 एल हिलनेवाला फ्लास्क में 250 एमएल लेग मीडिया टीका लगाना डिग्री सेल्सियस और कक्षीय प्रकार के बरतन के साथ एक मशीन में 166 rpm.
3. चार चकरा के साथ 5 एल हिलनेवाला बोतल एमएल 250 (प्रत्येक कुप्पी के लिए 50 एमएल) संस्कृति और 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है और 0.8 के 166 rpm के एक आयुध डिपो ₆₀₀ जब तक संस्कृतियों में सेते के साथ 2.5 एल लेग मीडिया वाले प्रत्येक. टीका लगाना
4. Centrifugation द्वारा कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 3000x छ हार्वेस्ट. 0-4 ° C पर या बर्फ पर आगे से निपटने के प्रदर्शन.
5. मिल्ली क्यू पानी में काटा सेल सामग्री पुनः निलंबन, 6000x जी पर एक और 30 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक अपकेंद्रित्र बाल्टी और अपकेंद्रित्र में गठबंधन
6. -20 डिग्री सेल्सियस या -78 डिग्री सेल्सियस के परिणामस्वरूप 20 ग्राम सेल सामग्री स्टोर
7. 100 एमएल बर्फ ठंड सेल खोलने बफर (6.7 मिमी एमईएस, 6.7 मिमी NaOAc, 6.7 मिमी HEPES, 1 मिमी EDTA, 10 मिमी β-mercaptoethanol, 200 मिमी NaCl, 7.5 पीएच, 10% (w / ध् में कोशिकाओं पुनः निलंबित) ग्लिसरॉल, 0.2 मिमी PMSF) और बर्फ पर चार 25 एमएल भाग एक sonifier (जैसे SONOPULS 2070 HD BANDELIN इलेक्ट्रॉनिक GmbH एंड कं किलोग्राम, अधिक से अधिक आयाम, निरंतर उत्पादन से) का उपयोग कर में 1 मिनट के लिए तीन बार sonicate.
8. रात खत्म 2370x जी और 2 डिग्री सेल्सियस पर lysate अपकेंद्रित्र
9. 14 एमएल 2370x जी और 2 डिग्री सेल्सियस पर ultrafiltration (जैसे चिह्न पियर्स से concentrators, 7 mL/9K, का उपयोग) के द्वारा सतह पर तैरनेवाला ध्यान लगाओ
10. एसएएम या SAH 2 में जेल निस्पंदन द्वारा की तरह छोटे अणुओं से चिपचिपा ध्यान केंद्रित खलाना डिग्री सेल्सियस (जैसे Zeba फीका बनाना स्पिन कॉलम, पियर्स से 10 एमएल, चार स्तंभों, 5 एमएल के साथ चार बार संतुलन, भंडारण बफर 1000x जी पर 2 मिनट के लिए हटाया बर्फ ठंड सेल खोलने बफर बफर और 2 मिनट के लिए 1000x जी पर निकाल दिया, क्रमशः, प्रत्येक स्तंभ के लिए 3.5 एमएल लागू ध्यान केंद्रित; 24x छ पर 45 मिनट centrifugation, तब दो बार 1000x जी पर 2 मिनट)
11. 13 एमएल बर्फ ठंड ग्लिसरॉल और रॉश मिनी protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल गोलियाँ, EDTA मुफ्त के साथ जिसके परिणामस्वरूप 13 एमएल lysate अनुपूरक. मिश्रण और गोलियाँ भंग.
12. -20 डिग्री सेल्सियस पर lysate स्टोर
13. ब्रैडफोर्ड परख (21 मिलीग्राम / वर्तमान मामले में मिलीलीटर) के द्वारा कुल प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक: 100 मिलीग्राम Coomassie खूब ब्लू 50 एमएल 95% इथेनॉल G-250, वाटमान # 1 कागज के माध्यम से 100 एमएल 85% (w / v) फॉस्फोरिक एसिड, 1 एल जब डाई पूरी तरह भंग है पतला, और फिल्टर जोड़ने बस उपयोग करने से पहले.

2 कैद) (ए) परख, प्रतियोगिता नियंत्रण (सी), Pulldown (पीडी), Pulldown (सीपीडी) की प्रतियोगिता नियंत्रण, और संयुक्त कैद परख प्लस pulldown (ए पीडी +)

1. कब्जा प्रयोगों के लिए, SAH caproKit (caprotec bioanalytics GmbH) इस्तेमाल किया गया था जो SAH-सीसी, प्रतियोगी के रूप में मुक्त SAH, streptavidin सुक्ष्ममापी 1 (Dynabeads MyOne streptavidin C1, Invitrogen Dynal) व्यास, 5X कब्जा बफर के साथ लेपित चुंबकीय मोतियों शामिल (5X सीबी, में 100 मिमी HEPES, 250 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 50 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट और 50% ग्लिसरॉल से युक्त), और 5X धोने (बफर 5X वाइड, 250 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5, 5 मिमी EDTA, 5 एम NaCl, 42.5 युक्त सुक्ष्ममापी octyl _β-डी - glucopyranoside).
2. कई समानांतर प्रयोगों के लिए यह करने के लिए पानी की एक मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए सिफारिश की है, बफर और ई. पर कब्जा कोलाई lysate और एक 200 ट्यूब μL-पीसीआर पट्टी के विभिन्न ट्यूबों के भीतर प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन (अनुशंसित 0.2 एमएल थर्मो - पट्टी, थर्मो वैज्ञानिक, एबी 1114) . यहाँ, एक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए मात्रा में दिया जाता है. परिणाम के पांच अलग अलग प्रयोगों के लिए, प्रस्तुत किया जाएगा, जो कब्जा परख (ए), प्रतियोगिता नियंत्रण (सी), (पीडी) pulldown, pulldown (सीपीडी) की प्रतियोगिता नियंत्रण, और संयुक्त कब्जा परख प्लस pulldown (ए + पीडी) कर रहे हैं.
3. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, मिल्ली क्यू पानी के 1.2 एमएल 0.3 एमएल 5X वाइड जोड़कर 1.5 एमएल 1X वाइड तैयार करते हैं.
4. 200 μL पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स में SAH सीसी लोड streptavidin लेपित चुंबकीय मोती (caproBeads) तैयार करें. इसलिए प्रत्येक विभाज्य के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों की 50 μL के साथ SAH-100 सीसी सुक्ष्ममापी 25 μL मिश्रण करने के लिए, सख्ती से 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जिसके परिणामस्वरूप निलंबन के बायोटिन आधा भाग के बंधन की अनुमति हिला SAH- चुंबकीय मनका सतह पर streptavidin, और मोती (पीसीआर ट्यूब caproMagTM चुंबकीय डिवाइस, caprotec bioanalytics GmbH का उपयोग स्ट्रिप्स टोपी में उदा) एक मजबूत चुंबक का उपयोग कर इकट्ठा करने के लिए सीसी. Supernatants त्यागें, 200 μL पश्चिम बंगाल में जिसके परिणामस्वरूप caproBeads फिर स्थगित करता है, चुंबकीय caproBeads (पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स की टोपी में) इकट्ठा, और supernating पश्चिम बंगाल त्यागें. बंद ट्यूबों मोतियों की सुखाने से बचने के लिए.
5. ई. कोलाई DH5α पूरे के aliquots तैयारनए पीसीआर नलियों में 0-4 पर सेल lysate डिग्री सेल्सियस एक मास्टर मिश्रण का उपयोग (2.2 देखें). एक प्रतिक्रिया के लिए, 20 μL 5X सीबी के साथ 100 μL की एक अंतिम प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा के लिए मिल्ली - क्यू पानी के एक मात्रा के पूरक. मिक्स, 0.26 मिलीग्राम ई. जोड़ने कोलाई lysate, और धीरे उलटा द्वारा मिश्रण. सी और CPD के लिए केवल 20 μL 10 मिमी SAH प्रतियोगी समाधान जोड़ने और धीरे से उलटा द्वारा मिश्रण (ए, पीडी, और ए + पीडी मिल्ली - क्यू के बजाय SAH समाधान पानी जोड़). आगे के विश्लेषण के (नीचे देखें) के लिए एक से एक 1 μL नमूना ड्रा.
6. संबंधित lysate और 4 में 3 घंटे के लिए सेते में caproBeads निलंबित डिग्री सेल्सियस रोटेशन से निलंबन में मोती रखने के लिए SAH बंधनकारी प्रोटीन की प्रतिवर्ती SAH-सीसी की SAH चयनात्मकता समारोह के लिए बाध्य की अनुमति.
7. निलंबन ए, सी और ए + पीडी में caproBoxTM (यूवी प्रकाश और एक साथ ठंडा, caprotec bioanalytics GmbH के साथ जैव रासायनिक नमूनों irradiating के लिए डिवाइस) और 0-4 के बीच बंद नलियों में एक 30 मिनट की कुल समय के लिए चमकाना प्लेस डिग्री सेल्सियस SAH-सीसी का जेट SAH बंधनकारी प्रोटीन समारोह के बीच एक सहसंयोजक crosslink फार्म. इसलिए, विकिरण अंतराल के बाद 2.5 मिनट के निलंबन निकालने के लिए, क्रमशः, caproBoxTM से, बर्फ के पानी में ~ 15 एस (विशेष रूप से lids के) के लिए शांत, उलटा द्वारा कई बार मिश्रण करने के लिए, बहुत जल्द ही (~ 2 एस) अपकेंद्रित्र शेष निलंबन हटायें lids, और अगले विकिरण अंतराल के लिए caproBoxTM में वापस जगह में.
8. एक, या 20 μL पानी मिल्ली क्यू सी, पीडी, CPD, और एक + पीडी से 20 μL 10 मिमी SAH समाधान जोड़ें और 4 बजे 10 मिनट के लिए निलंबन सेते ° सी, ए में विस्थापित करने के लिए, SAH बाध्यकारी प्रोटीन Crosslinked नहीं SAH-सीसी के लिए. निलंबन में रोटेशन या आंतरायिक पुस्तिका फिर से निलंबन द्वारा मोती रखें.
9. (CaproMagTM जैसे) एक मजबूत चुंबक का उपयोग निलंबन से caproBeads ले लीजिए, supernatants त्यागें, और मोती छह बार धो - 200 μL 1X वाइड और 200 एक बार के साथ μL मिल्ली क्यू पानी के साथ फिर से निलंबन और संग्रह से.
10. मोती कई हफ्तों के लिए मिल्ली - क्यू पानी में 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है वैकल्पिक प्रोटोकॉल कब्जा कर लिया प्रोटीन और उनकी पहचान के आगे प्रसंस्करण के लिए मौजूद (चर्चा देखें).
11. मोती 200 μL 60% acetonitrile (ACN) के साथ तीन बार धो लें और 10 कमरे के तापमान पर जोरदार मिनट ऊष्मायन के तहत 200 μL 60% ACN/0.2% trifluoroacetic एसिड (TFA) के साथ मिलाते हुए मोतियों से कब्जा कर लिया प्रोटीन रिहाई (हौसले से तैयार) . LC-एमएस ग्रेड अभिकर्मकों और पानी का उपयोग करें.
12. चुंबकीय मोतियों को एकत्र, अलग और सतह पर तैरनेवाला एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण (Genevac, Inc, ब्रिटेन से जैसे MiVac डीएनए concentrator) का उपयोग सूखापन के लिए लुप्त हो जाना. मोती त्यागें.

3) पकड़े प्रोटीन की एसडीएस PAGE

1. एसडीएस पृष्ठ के लिए, पर कब्जा कर लिया 20 μL एसडीएस नमूना बफर (50 मिमी Tris एचसीएल, 320 मिमी β-mercaptoethanol, एसडीएस 2.5%, 0.05% bromophenol नीले (2.12 कदम से / ACN TFA समाधान सुखाया) में चुंबकीय मोतियों से जारी प्रोटीन भंग , 10% ग्लिसरॉल, 6.8 पीएच). 1 μL (कदम 2.5 देखें) के साथ 19 μL एसडीएस नमूना बफर से तैयार नमूना मिक्स, एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए इस समाधान के 5 μL का उपयोग करें (परख की 0.25%). एसडीएस नमूना बफर 10 मिनट में नमूने 95 सी सेंटीग्रेड और हीट के लिए कमरे के तापमान शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
2. 25 मिमी tris आधार, 200 मिमी ग्लाइसिन, 0.1% एसडीएस, 8.3 पीएच:; एसडीएस OLS omniPAGE मिनी जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली चल रहा है बफर OLS ® 4-20% / Tris ग्लाइसिन जैल पूर्व डाली ProPage: एसडीएस पृष्ठ (जेनेरिक सेटअप द्वारा विश्लेषण , एसडीएस चल रहा है बफर के ठंडा बर्फ के तहत एक निरंतर वोल्टेज 180 वी के समय 90 मिनट चलाने के लिए).
3. रजत एक एमएस संगत चांदी दाग ​​विधि (जैसे सिग्मा से ProteoSilver रजत दाग किट) का उपयोग कर जेल दाग. एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है.

4) में जेल जेल बैंड से प्रोटीन और पेप्टाइड निकालना Tryptic डाइजेस्ट

1. चांदी दाग ​​जेल 10 मिनट के लिए 100 एमएल पानी मिल्ली - क्यू के साथ कम से कम तीन बार धो चांदी दाग ​​रोकने के समाधान के बाद हटा दिया गया था.
2. जेल बैंड (उदाहरण के लिए एक 0.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में एक स्वच्छ स्केलपेल और हस्तांतरण का उपयोग कर) और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान या सीधे प्रक्रिया बाहर कट. 15 मिनट के लिए धो जेल बैंड, क्रमशः 100 μL पानी, 100 μL 50% इथेनॉल, 100 μL पानी, 100 μL 50% इथेनॉल, और शुद्ध इथेनॉल के साथ 5 मिनट के लिए के साथ. एक बार फिर इस धोने प्रक्रिया दोहराएँ.
3. पुनः हाइड्रेट पाचन समाधान के जेल में 10 μL के साथ जेल बैंड (12.5 एनजी / μL अनुक्रमण 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट में ग्रेड trypsin, 1 मिमी एचसीएल में 292.5 μL 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट 7.5 μL 0.5 μg / μL trypsin समाधान जोड़कर तैयार ) डिग्री सेल्सियस 4 में 45 मिनट के लिए निकालें सतह पर तैरनेवाला और 20 μL 50 मिमी अमोनियम (trypsin बिना) बिकारबोनिट 37 ° से अधिक सी रात ऊष्मायन द्वारा पीछा किया, जबकि मिलाते द्वारा जगह.
4. सतह पर तैरनेवाला लीजिए. पेप्टाइड निकासी के लिए, 20 μL 5% चींटी एसिड (एफए) के साथ 15 मिनट के लिए जेल बैंड जबकि मिलाते सेते हैं, जोड़ने20 μL ACN और एक और 15 मिनट के लिए incubated जबकि मिलाते हुए. पिछले सतह पर तैरनेवाला के साथ सतह पर तैरनेवाला का मिश्रण है और पेप्टाइड निष्कर्षण प्रक्रिया एक बार फिर दोहराने.
5. सूखापन के लिए संयुक्त तीन supernatants लुप्त हो जाना, 10 μL 5% एफए में भंग करते हुए मिलाते और आवेदन अल्ट्रासाउंड (अल्ट्रासाउंड स्नान, Bandelin से जैसे Sonorex, जर्मनी) और desalting (5.2 और आगे कदम) के साथ आगे बढ़ना.

5) पकड़े प्रोटीन की Tryptic डाइजेस्ट और LC-MS/MS के लिए पेप्टाइड्स की तैयारी

1. पर कब्जा कर लिया 10 μL 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट में चुंबकीय मोती (2.12 कदम से सुखाया समाधान / ACN TFA) एक अल्ट्रासाउंड स्नान और vortexing का उपयोग कर से जारी प्रोटीन भंग करने के लिए, 1 मिमी एचसीएल में एक μL 0.5 μg / μL trypsin जोड़ सकते हैं और समाधान सेते 37 ° सी रात खत्म.
2. 10 μL मेथनॉल 50% / 5 के साथ पूर्व शर्त: कब्जा कर लिया C18 सामग्री का उपयोग प्रोटीन की tryptic पेप्टाइड्स (जैसे 2-10 StageTips μL, 20 μL टिप, Proxeon ए / Biosystems एस, ओडिन्सा, डेनमार्क, निर्माता प्रक्रिया युक्त समाधान फीका बनाना % एफए, 10 μL 5% एफए के साथ संतुलित करना, कब्जा कर लिया प्रोटीन के पेप्टाइड्स के साथ लोड, 10 μL 5% एफए के साथ धोने, 10 μL में 50% मेथनॉल / 5% एफए) के साथ दो बार elute.
3. मेथनॉल 50% / 5% सूखापन के लिए एफए में desalted पेप्टाइड्स लुप्त हो जाना, 5.5 μL 0.1% एफए में भंग, जबकि मिलाते और अल्ट्रासाउंड (अल्ट्रासाउंड स्नान) लागू करने और nanoLC-MS/MS द्वारा नमूना विश्लेषण.

6) NanoLC-MS/MS विश्लेषण

1. नैनो प्रवाह (nanoLC) तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली (, Proxeon ए / एस Biosystems, डेनमार्क जैसे आसान एनएलसी तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली) में नमूना नमूना थाली और जगह की थाली में स्थानांतरण.
2. मोबाइल चरण के रूप में पानी में 0.1% एफए का प्रयोग करें एक और ACN में मोबाइल चरण बी केवल LC-एमएस ग्रेड सॉल्वैंट्स का उपयोग के रूप में 0.1% एफए.
3. एक पूर्व स्तंभ पर सीधे पेप्टाइड समाधान के 5 μL लोड (जैसे nanoflow C18 बायोस्फीयर, 5 सुक्ष्ममापी, 120 ए, 20 x 0.1 मिमी, NanoSeparations, नीदरलैंड) एक विश्लेषणात्मक स्तंभ (जैसे nanoflow बायोस्फीयर C18, 5 सुक्ष्ममापी, 120 Å युग्मित , x 100 0.075 मिमी, NanoSeparations, नीदरलैंड्स) 5% ACN/0.1% एफए का उपयोग.
4. नियंत्रण रेखा एक 80 मिनट 5 ACN/0.1% एफए% से 40% ACN/0.1% के बाद एक अतिरिक्त 2 मिनट 100 ACN/0.1%% एफए और 100% ACN/0.1% शेष एफए रैखिक ढाल के दौरान, elute पेप्टाइड्स के दौरान 400 nl / मिनट की एक नियंत्रित प्रवाह की दर के साथ एक और 8 मिनट के लिए एफए.
5. थर्मो FisherScientific, जर्मनी, electrospray ionization (ईएसआई) के लिए एक nanoelectrospray आयन स्रोत के साथ सुसज्जित; Proxeon बड़े पैमाने पर राज्य के-the-कला मास स्पेक्ट्रोमीटर (जैसे LTQ Orbitrap एक्स्ट्रा लार्ज मास स्पेक्ट्रोमीटर एक उच्च सटीकता पर spectrometric (एमएस) eluted पेप्टाइड्स का विश्लेषण करें Biosystems / एस, डेनमार्क).
6. डेटा पर निर्भर मोड में बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए स्वचालित रूप से (प्रोफ़ाइल मोड) Orbitrap एमएस और LTQ-MS/MS (केन्द्रक मोड) अधिग्रहण के बीच स्विच करने के लिए.
7. इंजेक्शन समय स्वत: प्राप्त नियंत्रण की स्थापना द्वारा नियंत्रण मास स्पेक्ट्रोमीटर कर्तव्य चक्र.
8. सर्वेक्षण मोल पूर्ण स्कैन एमएस स्पेक्ट्रा (z / मीटर से 300 2000) संकल्प = r 60,000 मीटर / 400 z पर (रैखिक आयन जाल में 500,000 आरोपों का लक्ष्य मूल्य संचय के बाद) के साथ Orbitrap में.
9. साधन का सेट sequentially रैखिक आयन जाल में 10,000 प्रभारों का लक्ष्य मूल्य पर टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) का उपयोग विखंडन के लिए सबसे तीव्र आयनों (ऊपर पांच संकेत तीव्रता के आधार पर) अलग. परिणामस्वरूप टुकड़ा आयनों LTQ में दर्ज कर रहे हैं.
10. एमएस मोड में सटीक जन मापन के लिए, वास्तविक आंतरिक समय के लिए अकेले polydimethylcyclosiloxane पृष्ठभूमि चार्ज (सी _{(3 CH) 2} हे) _आयन 6 ^एच + (मीटर / z 445.120025) परिवेशी वायु से बड़े पैमाने पर ताला के रूप में electrospray प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न का उपयोग recalibration.
11. गतिशील लक्ष्य आयनों बाहर पहले से ही 60 की अवधि के एस के लिए सीआईडी ​​के लिए बड़े पैमाने पर चयनित
12. प्रभारी राज्य स्क्रीनिंग और सीआईडी ​​के लिए असाइन नहीं की गई प्रभारी के साथ आयनों की अस्वीकृति सेट.
13. इसके अलावा बड़े पैमाने पर spectrometric सेटिंग्स निम्नानुसार हैं: 1.6 केवी, गर्म हस्तांतरण के सेट तापमान 200 से केशिका डिग्री सेल्सियस, और सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा ² एमएस के लिए 35% है स्प्रे वोल्टेज सेट कम से कम ² एमएस के लिए आवश्यक संकेत 500 मायने रखता है. एक सक्रियकरण = क्ष 0.25 और 30 एमएस के एक एमएस ² अधिग्रहण के लिए सक्रियण के समय लागू करें .
14. नियंत्रण रेखा प्रणाली को साफ करने के लिए, एक लगातार दो CCMS माप के बीच रिक्त रन का प्रदर्शन करते हैं.

7) स्वचालित अनुक्रम डेटाबेस खोज के माध्यम से पेप्टाइड और प्रोटीन की पहचान

1. एक प्रोटीन की पहचान एल्गोरिथ्म का उपयोग एमएस / एमएस (वर्तमान में कच्चे फ़ाइलों में संग्रहीत मामले में) डेटा, जैसे BioworksBrowser 3.3.1 (FisherScientific थर्मो, जर्मनी) SP1 और X! अग्रानुक्रम (ग्लोबल proteome मशीन संगठन में लागू SEQUEST विश्लेषण; संस्करण सुप्रीम कोर्ट में 2007.01.01.1) लागूaffold 3 सॉफ्टवेयर (Scaffold_3_00_03 संस्करण, proteome सॉफ्टवेयर, Inc, संयुक्त राज्य अमरीका).
2. सबसे हाल ही में UniProtKB / जांच (Escherichia कोलाई, K12 तनाव, 57-11 रिलीज वर्तमान अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया डेटाबेस) जीव की स्विस prot डेटाबेस रिलीज www.expasy.org के खिलाफ स्वचालित डेटाबेस खोज प्रदर्शन.
3. 5 पीपीएम अग्रदूत सहिष्णुता, 1 एएमयू टुकड़ा आयन सहिष्णुता, और पूर्ण trypsin दो याद चोली के लिए अनुमति देता है विशिष्टता: स्वचालित SEQUEST भीतर खोज डेटाबेस के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें. Methionines के ऑक्सीकरण, asparagines और glutamine पर deamidation, lysine और सेरीन पर एसिटिलीकरण, lysine पर formylation, और arginine, lysine, सेरीन, threonine पर मेथिलिकरण, और asparagine सेरीन, threonine, और tyrosine पर चर संशोधनों की phosphorylation के रूप में अनुमति दें. डेटाबेस खोज में तय संशोधनों का उपयोग नहीं करें.
4. लोड SRF या डीटीए और बाहर 3 पाड़, जो पेप्टाइड कार्य और प्रोटीन की पहचान की SEQUEST और X! अग्रानुक्रम डेटाबेस खोजों के संयोजन द्वारा संभावना मूल्यांकन प्रदर्शन में SEQUEST द्वारा उत्पन्न फ़ाइलों. पाड़ आसानी से तुलना और visualizing कई नमूनों से प्रोटीन सूची के लिए उपयोगी है (वर्तमान मामले में ए, सी, पीडी, CPD, और एक + पीडी).
5. पाड़ 3 सॉफ्टवेयर के भीतर मापदंडों सेट ≥ 95% के रूप में पेप्टाइड पैगंबर एल्गोरिथ्म (ref.13) द्वारा निर्दिष्ट प्रायिकता के साथ ही पेप्टाइड्स पर विचार. प्रोटीन पैगंबर ¹³ एल्गोरिथ्म के अनुसार कई पेप्टाइड ≥ 95% करने के लिए कार्य के लिए प्रोटीन की पहचान संभावनाओं सेट एकल पेप्टाइड प्रोटीन पहचान के लिए मनमाने ढंग से प्रोटीन संभाव्यता स्थापित करने के लिए ≥ 50% और मैन्युअल रूप से इसी पेप्टाइड स्पेक्ट्रा एमएस / एमएस निरीक्षण किया. प्रोटीन है कि इसी तरह पेप्टाइड्स शामिल और हो एमएस / एमएस अकेले विश्लेषण पर आधारित भेदभाव नहीं कर सका बचत के सिद्धांतों को संतुष्ट करने के लिए सॉफ्टवेयर के द्वारा समूहीकृत कर रहे हैं. अनुमानित पेप्टाइड पहचान की झूठी खोज दर उलट प्रोटीन डेटाबेस दृष्टिकोण का उपयोग कर और <1% होना चाहिए निर्धारित किया जा सकता है.
6. CCMS प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणाम टेबल्स 1, 2 में दिया जाता है, और अनुपूरक टेबल S1 (मन है कि प्रोटीन डेटाबेस कुछ प्रोटीन के लिए अप करने की तारीख नहीं है, जैसे (उर्फ YfcB) PrmB या RsmH (उर्फ MraW)), के रूप में अच्छी तरह से चित्रा 3 में.

8) प्रतिनिधि परिणाम

तालिका 1:

^एक विशेषता नहीं है (पूरी तरह)

^ख नहीं लेकिन SAH के glycosidic बंधन के मेथिलिकरण दरार

^ग नहीं मेथिलिकरण लेकिन एटीपी बाध्यकारी साइट में SAH के बंधन के रूप में प्रतियोगी के रूप में एटीपी के साथ CCMS प्रयोगों (नहीं दिखाया डेटा ) द्वारा दिखाया गया है

^घ 50s ribosomal प्रोटीन L11 MTase PrmA के सब्सट्रेट, CCMS (नहीं दिखाया डेटा) द्वारा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विशिष्ट पहचान

तालिका 1: MTases और अन्य चयनित CCMS प्रयोगों द्वारा पहचान प्रोटीन. दिए गए नंबरों प्रोटीन प्रति unweighted पेप्टाइड वर्णक्रमीय गिनती निरूपित. नमूने हैं SDS-PAGE/silver द्वारा विश्लेषण उन के डुप्लिकेट चित्रा 2 में दाग. CCMS परख (पीडी) pulldown और SAH विशिष्टता प्रतियोगिता नियंत्रण में इन प्रोटीनों की लगभग पूर्ण अभाव (सी) के द्वारा दिखाया गया है की तुलना में (ए) में बहुत अधिक MTases और अन्य SAH बंधनकारी प्रोटीन की पहचान कर रहे हैं .

तालिका 2:

तालिका 2: CCMS रन और रन प्रोटीन ओवरलैप के बीच में पहचान प्रोटीन की कुल संख्या . कम से कम 2 पेप्टाइड्स के साथ पहचान प्रोटीन की संख्या कोष्ठकों में दिए गए हैं. विधि के उच्च reproducibility उच्च प्रोटीन ओवरलैप से inferred किया जा सकता है (मुख्य रूप से unspecific प्रोटीन की (ए बनाम सी और विशेष रूप से एक बनाम A + पीडी लेकिन यह भी पीडी बनाम सीपीडी) के साथ robustly पहचान प्रोटीन के साथ विशेष रूप से तुलनीय प्रयोगों के बीच) कम से कम 2 पेप्टाइड्स. वेन सभी प्रोटीन की पहचान एक सूची के लिए और चित्र पूरक टेबल S1 के लिए भी देखें चित्रा 3 .

चित्रा 1A: trifunctional कैद यौगिक (सीसी) की रासायनिक संरचना. चयनात्मकता समारोह एक छोटी बूंद, एक स्टार के साथ जेट समारोह, और एक आधा चाँद के साथ छँटाई समारोह के साथ फंसाया है. रासायनिक स्थिर एस _{adenosyl-एल} homocysteine ​​(SAH) एस _{adenosyl-एल} methionine के cofactor मिथाइल समूह के स्थानांतरण के बाद सैम निर्भर MTases, जिसके लिए SAH एक उत्पाद अवरोध करनेवाला के रूप में कार्य करता है के द्वारा (एसएएम) उत्पाद है.

पर CCMS ": चित्रा 1Bमनका "वर्कफ़्लो सीसी चुंबकीय मोतियों पर अपनी सॉर्टिंग समारोह (क) से बाध्य है, तो गठन caproBeads जटिल प्रोटीन (ख) मिश्रण है, जहां एक प्रतिवर्ती बंधन संतुलन (ग) चयनात्मकता के समारोह के बीच स्थापित किया है के साथ incubated हैं सीसी और लक्ष्य प्रोटीन. यूवी विकिरण होने पर (घ), जेट समारोह सहसंयोजक crosslink रूपों. चुंबकीय मोतियों पर कब्जा कर लिया प्रोटीन (ई), चुंबकीय मोतियों से Crosslinked सीसी प्रोटीन परिसरों की दरार (च) असर धोने के बाद और tryptic पचाने में (छ), पर कब्जा कर लिया प्रोटीन एमएस tryptic पेप्टाइड्स के विश्लेषण के द्वारा की पहचान की जा सकता है.

चित्रा 2: SDS-PAGE/silver कब्जा कर लिया प्रोटीन के दाग विश्लेषण (चित्रा 1 बी में कदम च के बाद) . 0.25% नमूना ई. कोलाई DH5a पूरे सेल lysate caproBeads जोड़ने से पहले से तैयार:; एल मार्कर बहुत सही करने के लिए दिया बैंड की इसी आणविक भार के साथ आणविक भार मार्कर: लेन वर्णन जेल (मेगावाट के शीर्ष पर दिया जाता है परख, चित्रा 1B में यूवी विकिरण कदम घ के बाद मुक्त SAH के एक अतिरिक्त के अलावा के साथ सी: मुक्त SAH के चरणों ग और घ के दौरान एक प्रतियोगी के रूप में चित्रा 1 बी में अतिरिक्त (आवश्यक सहित परख के नियंत्रण एक, चित्रा 1 बी में कदम ख में : पुलडाउन अर्थ चित्रा 1 बी में कोई यूवी विकिरण कदम घ और मुक्त SAH के कोई अतिरिक्त; CPD:, किसी भी गैर विशेष रूप से कब्जा कर लिया प्रोटीन का निर्धारण) पीडी प्रतियोगी के रूप में SAH का उपयोग pulldown के नियंत्रण, ए पीडी +: संयुक्त परख अधिक नहीं इसके अलावा अर्थ pulldown वर्कफ़्लो के दौरान मुक्त SAH के). बाद में जेल tryptic पचाने में बाहर कट प्रोटीन जेल बैंड से एमएस द्वारा की पहचान की प्रोटीन बहुत leftt दिया जाता है. यह स्पष्ट है कि तस्वीर crosslinking उपज और प्रयोग की संवेदनशीलता को बढ़ाता है, और विशिष्टता प्रतियोगिता मुक्त SAH के एक अतिरिक्त का उपयोग कर प्रयोगों में आसानी के लिए परीक्षण किया जा सकता है. MTases और अन्य चयनित वर्तमान आंकड़े में दिखाया उन के नकली नमूने के CCMS प्रयोगों के द्वारा की पहचान की प्रोटीन के लिए 1 टेबल देखें.

चित्रा 3: वेन CCMS परख में पहचान प्रोटीन की ओवरलैप explaning (ए), (सी) प्रतियोगिता, नियंत्रण, और pulldown (पीडी) आरेख . वाम: MTases और SAH nucleosidase, केवल की संख्या, तालिका 1 की बात है. राइट: सभी की पहचान की तालिका 2 और पूरक टेबल S1 जिक्र करने के लिए प्रोटीन की संख्या. कम से कम 2 पेप्टाइड्स के साथ पहचान प्रोटीन की संख्या कोष्ठकों में दिए गए हैं.

निम्न सावधानियाँ और टिप्पणियों उपयोगी हो सकता है जब वर्णित प्रोटोकॉल का पालन कर सकते हैं:) सीसीएस की एक प्रमुख लाभ सीसी और MTase के बीच एक सहसंयोजक बंधन के गठन में निहित है, के रूप में इस बाद कड़े धोने शर्तों परमिट. सहसंयोजक crosslink एक यूवी प्रकाश (310 एनएम अधिकतम) द्वारा ट्रिगर photoreaction द्वारा हासिल की है. सामान्य उपरि प्रकाश यूवी के केवल एक छोटा सा अंश होते हैं, तथापि, अब भूमि के ऊपर या यहां तक ​​कि सूरज की रोशनी के लिए जोखिम caproBox में नियंत्रित और ठंडा विकिरण से SAH सीसी की रक्षा. ख) जैविक नमूनों से जो MTases के लिए अलग हो रहे हैं विकृतीकरण के लिए प्रवण प्रोटीन शामिल कर सकते हैं, फलस्वरूप यह अनिवार्य है नमूनों को शांत रखने के लिए और सभी समय पर frothing से बचने के. ग) caproBox 0-4 नमूने ठंडा डिग्री सी, यूवी प्रकाश उत्सर्जक लैंप, तथापि, भी गर्मी फेंकना. इसलिए यह संक्षिप्त विकिरण से पहले शीशियों अपकेंद्रित्र के लिए आवश्यक है, तो टोपी या शीशी दीवारों का पालन प्रोटीन वर्षण बीज फार्म नहीं कर सकते हैं. घ) यदि चुंबकीय मोतियों की फिर से निलंबन (जैसे धोने समाधान में) के हाथ से संभव नहीं है, शीघ्र ही एक अल्ट्रासाउंड स्नान में नमूने रखकर अल्ट्रासाउंड लागू. ई) हौसले 0.2% TFA/60% ACN समाधान तैयार करते हैं. हमने पाया है कि अन्यथा कब्जा कर लिया प्रोटीन मोतियों से cleaved नहीं हो सकता है. च) पर कब्जा कर लिया प्रोटीन की अंतिम विश्लेषण LC-MS/MS द्वारा किया जाता है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक बेहद संवेदनशील तरीका है. यह अंतिम कदम (2.11 और आगे कदम) में विशेष रूप से LC-एमएस ग्रेड अभिकर्मकों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. प्रयोगों के बाहरी प्रोटीन स्रोत, जैसे धूल से या experimenter से प्रारंभिक केरातिन द्वारा संदूषण से बचें. अंतिम पाचन के चरणों के दौरान विशेष रूप से, यह एक स्वच्छ काम की जगह पर ध्यान देना, दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट और संभवतः एक बाल शुद्ध पहनने या आदर्श एक साफ बेंच के तहत अंतिम चरणों का पालन करने के लिए सिफारिश की है. 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट बफर MS नियंत्रण रेखा ग्रेड पानी में tryptic पचाने में के लिए इस्तेमाल किया, 0.22 सुक्ष्ममापी फ़िल्टर -20 ° सी में, विभाज्य स्टोर, के माध्यम से फिल्टर तैयार है, और केवल एक बार प्रत्येक विभाज्य का उपयोग करने के लिए contaminations से बचने. trypsin समाधान (अनुक्रमण ग्रेड, Roche, एक 0.5 μg / lyophilized trypsin 1 मिमी एचसीएल जोड़कर μl समाधान तैयार) 4 डिग्री सेल्सियस कई हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है. छ) करने के लिए विश्वसनीय जन स्पेक्ट्रा प्राप्त ESI-MS/MS विश्लेषण में एक स्थिर स्प्रे करने के लिए आवश्यक है. ज) वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल एक से दूसरे LC-MS/MS सिस्टम के लिए, अलग - अलग माप मानकों और पेप्टाइड पहचान एल्गोरिदम समायोजित किया जाना चाहिए.

निम्नलिखित संशोधनों वर्णित प्रोटोकॉल करने के लिए सम्मान के साथ संभव हो रहे हैं: एक) वैकल्पिक रूप से 60% ACN/0.2% TFA (2.11 कदम) द्वारा मोतियों से प्रोटीन को रिहा करने के लिए, प्रोटीन सीधे tryptically एक मनका (निलंबन के भीतर कर सकते हैं पचा उसी के रूप में मात्रा 5.1 कदम) या, एसडीएस पृष्ठ के लिए, प्रोटीन 2.9 कदम के बाद 95 को एकत्र मोतियों को निलंबित और हीटिंग के द्वारा जारी किया जा सकता है डिग्री सेल्सियस एसडीएस नमूना बफर में 10 मिनट (दोनों पूरे निलंबन या केवल सतह पर तैरनेवाला लोड किया जा सकता है के लिए जेल की जेब में). हमने पाया है कि मोती धीरे धीरे कई जलीय धोने कदम के बाद भी जलीय tryptic पचाने में समाधान में बहुलक की छोटी मात्रा पर मनका tryptic पचाने में के दौरान जारी है. बहुलक संदूषण एमएस पेप्टाइड पहचान के साथ हस्तक्षेप और 80% ACN (कम से कम तीन बार) का उपयोग करते हुए मोती धोया जा सकता है. 80% ACN धोने कदम के बाद, मोती पानी के साथ एक बार करना चाहिए पर मनका tryptic को पचाने के लिए पहले धोया. ख) पश्चिमी blots का उपयोग कर streptavidin horseraddish peroxidase और ईसीएल सब्सट्रेट भी प्रोटीन बायोटिन युक्त सीसी की सफल crosslinking कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, या तो 3.2 कदम के बाद प्राप्त की जेल या blotted किया जा सकता है, क्योंकि संवेदनशीलता के बारे में 10 गुना जैल की चांदी धुंधला की तुलना में अधिक है, 2.7 कदम के बाद 10 μl नमूने भी पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया जा सकता है. मन कि उत्तरार्द्ध मामले में endogeneously biotinylated प्रोटीन कृत्रिम SAH-सीसी द्वारा biotinylated प्रोटीन के अलावा भी पता लगाया जाएगा. ग) हमने पाया है कि यह विशेष प्रणाली (lysate, लक्ष्य प्रोटीन, चयनात्मकता और वह सीसी का जेट समारोह को संबोधित) पर निर्भर करता है, कि "बंद-मनका" विन्यास, जहां crosslinking प्रतिक्रिया मुक्त प्रतिलिपि ^और 4 समाधान में प्रोटीन के बीच जगह ले लेता है या वर्तमान में वर्णित विन्यास "पर मनका" (चित्रा 1 बी) बेहतर प्रदर्शन करती है.

सामान्य में, विधि भी साथ संगत होना चाहिए किसी भी राज्य के कला स्थिर आइसोटोप प्रोटीन पेप्टाइड या लेबलिंग तकनीक, या 2D जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा कब्जा नमूने के मूल्यांकन. "बंद मनका" विन्यास में, यह भी संभव है पूरे कोशिकाओं (अप्रकाशित परिणाम) के भीतर प्रोटीन पर कब्जा. इसके अलावा, दवा या एक प्रोटीन की बंधनकारी साइट cofactor प्रोटीन अनुक्रम के भीतर एमएस पेप्टाइड अनुक्रमण द्वारा करीबी द्वारा सीसी crosslinking स्थिति का निर्धारण द्वारा उल्लिखित किया जा सकता है है. एक प्रोटीन के लिए एक छोटा सा अणु के बंधन मोड अलग सी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता हैचयनात्मकता समारोह और विभिन्न linker लंबाई पर hemical लगाव पदों. जैसा कि वर्तमान अध्ययन में दिखाया गया है, भी प्रोटीन प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों चयनात्मकता (PrmA के सब्सट्रेट के रूप में RplK) समारोह या अज्ञात छोटे अणु प्रोटीन (GlnA के लिए SAH) बातचीत पहचाना जा सकता है के द्वारा संबोधित किया. संक्षेप, सीसीएस, जेट फोटो - crosslinking के अतिरिक्त सुविधा है, अलगाव और कम प्रोटीन प्रचुर मात्रा में उच्च संवेदनशीलता के साथ जटिल प्रोटीन मिश्रण से या कार्यात्मक प्रोटीन परिवारों की पहचान के लिए अनुमति देता है और छोटे अणु के अध्ययन के लिए एक अतिरिक्त उपकरण के साथ वैज्ञानिकों को प्रदान करता है - प्रोटीन बातचीत .

ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger, और HubertKosterare caprotec bioanalytics GmbH, इंक कि इस लेख में इस्तेमाल अभिकर्मकों कुछ पैदा द्वारा नियोजित है.

यह काम मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम संगठन (HFSP पुरस्कार 2007, RGP0058/2007-C) द्वारा समर्थित किया गया था. हम परियोजना की शुरुआत के लिए और उपयोगी विचार - विमर्श के लिए प्रो रिचर्ड रॉबर्ट्स धन्यवाद.

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