Применение NMDA-рецепторов в проводимости мозга крысы дофаминергических нейронов с помощью динамического Техника Clamp

Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique. J. Vis. Exp. (46), e2275, doi:10.3791/2275 (2010).

1. Подготовка фрагментов

1. Вырезать мозга ломтиками использованием вибрирующей микротоме. Мы подготовили 240 мкм горизонтальных срезов мозга от ИФ-anethetized Sprague-Dawley крыс (Charles River Laboratories) использованием вибрирующей микротома (Microm HM 650V) в соответствии с Техасского университета в Сан-Антонио Институциональные уходу и использованию животных комитета.
2. Держите ломтики в камере инкубации пока не будете готовы к записи. Мы используем инкубационный контейнер нагревается до 32 ° C и наполнен искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF; в мм): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 4 ₂ MgCl 2, CaCl _2, 10 декстрозы, 25 NaHCO _3, 1,3 аскорбиновой кислоты, 2,4 пируват натрия и 0,05 глутатиона.

2. Электрофизиологические Запись

1. Передача квант внутриклеточных установки записи, в которых искусственным спинномозговой жидкости (aCSF) при 35 ° C в настоящее время перфузии. Мы используем те же aCSF как и в 1,2 исключением того, что 2 мМ MgCl ₂ был использован и глутатион был опущен. Для горизонтально подготовленные ломтики, которые мы обычно делят пополам ломтик вдоль средней линии.
2. Визуализируйте цель нейрона. Мы визуализировать отдельные черной субстанции дофаминергических нейронов с изображениями система отличие градиент.
3. Вытяните электрода с помощью электронной съемник электрода. Тянем электродами с наконечником сопротивлением 4-10 МОм использованием P97 микропипетки съемник (Саттер Instrument Company).
4. Заполнить электрод с желаемой внутреннее решение. Мы используем раствор, содержащий (в мм): 138 К-глюконат, 10 HEPES, 2 MgCl _2, 0,2 EGTA, 0.0001 ₂ CaCl, 4 Na-АТФ, 0,4 Na-GTP. Внутренние раствора доводили до рН 7,3 использованием 1М КОН и осмолярность 270-275 mOsms.
5. Сделать gigaohm печать на нужный нейрон. Разрыв печать с всасывания. В этом заключается весь записи клетки. Усилитель Multiclamp 700B был использован в нашей конфигурации. Усилитель должен быть помещен в текущем режиме зажим 'I = 0'.

3. Проводимость приложения с динамической Clamp

1. RTXI (www.rtxi.org) был выполнен на компьютере динамическую зажимом. Пользовательских письменного модели, содержащей NMDA-рецепторов был загружен в память. Тока, вводят в клетку в реальном времени рассчитывается по следующей формуле:
   Я _NMDA =-г _NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * е ^(-V _м ^{* 0,062))]} * (V _м - E _NMDA), где г _NMDA является искомой проводимости (в нс; По умолчанию установлено в 0 нс), [Mg] является концентрация магния (устанавливается до 1,5 мм в нашем примере ниже), E _NMDA есть потенциал реверсии для NMDA-рецепторов (установлен в 0 мВ) и V _м мембранный потенциал ячейки измеряется от усилителя (в милливольтах).
2. Вывод динамических компьютер зажим был подключен к командной вход усилителя через аналого-цифровой преобразователь.
3. Усилитель был помещен в текущем режиме зажим 'IC'.
4. Введите желаемый NMDA рецепторов проводимости в RTXI (например 40nS). Вы должны увидеть фазовый взрыв потенциалов действия. Кроме того, проводимость может быть предоставлена ​​RTXI через аналоговый выход (рис. 1А, "г (т) '). Соответствующий коэффициент масштабирования следует использовать в течение RTXI для преобразования сигнала от вольт для Siemens.

4. Представитель Результаты

Успешной установки для применения проводимости с помощью динамического зажима показан на рисунке 1а. С помощью этой установки, мы сделали все соматической клетки записи с дофаминергических нейронов в черной субстанции Парс компактов. Дофаминергической клетки обычно спонтанно огонь по низким ценам с кардиостимулятором, как шаблон. Взрыв потенциалы действия могут быть вызваны фазовыми применения NMDA-рецепторов проводимости с динамическим зажим (рис. 1В).

Рисунок 1: Применение NMDA-рецепторов проводимости с помощью динамического техника зажима. А. Аппаратное обеспечение иллюстрирующие связь между внутриклеточными установки записи и динамических компьютер зажимом. Б. взрыв потенциалов действия вызывается путем применения 40nS NMDA-рецепторов проводимость в целом запись клетки от черной субстанции Парс компактов дофаминергических нейронов.

Динамический метод зажима продемонстрировали здесь улучшает традиционную технику постоянного тока инъекции, позволяя экспериментатором, чтобы имитировать электрических эффектов активации рецептора. В этом видео, мы показали, что можно добавить эффекты активации NMDA-рецепторов к спонтанной активности дофаминергических нейронов, то есть взрыв потенциалов действия вызываются.

Благодаря гибкости аппаратной / программной реализации, различные расширения могут быть использованы. Знак вводится ток может быть включен с отрицательного на положительный, что составляет сценарий, при котором эффекты активированного рецептора удаляется из нейрона. Модель нейронов, представить в виде серии дифференциальных уравнений, также может быть решена численно и позволяет экспериментатору для исследования малых сетей.

Нет конфликта интересов объявлены.

Эта работа была поддержана MH084494 (CJL), а MH079276 и NS060658 (CAP).

1. Robinson, H.P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49, 157-65 (1993).
2. Sharp, A.A., O'Neil M.B., Abbott, L.F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-94 (1993a).
3. Sharp, A.A., O'Neil, M.B., Abbott, L.F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69, 992-5 (1993b).
4. Prinz, A.A., Abbott, L.F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27, 218-24 (2004).
5. Deister, C.A., Teagarden, M.A., Wilson, C.J., Paladini, C.A. An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting. J Neurosci. 29, 15888-97 (2009).
6. Lobb, C.J., Wilson, C.J., Paladini, C.A. A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons. J Neurophysiol. 104, 403-13 (2010).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.