JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Italian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

L'applicazione di una conduttanza recettore NMDA nei neuroni dopaminergici mesencefalo Rat Utilizzando la tecnica dinamica morsetto

1, 1

1Neurosciences Institute, University of Texas San Antonio - UTSA

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    In questo video ci dimostra come applicare una conduttanza in un neurone dopaminergico registrato nella configurazione cellule intere fette di cervello di ratto. Questa tecnica è chiamata la pinza dinamica.

    Date Published: 12/21/2010, Issue 46; doi: 10.3791/2275

    Cite this Article

    Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique. J. Vis. Exp. (46), e2275, doi:10.3791/2275 (2010).

    Abstract

    Neuroscienziati studiare la funzione del cervello, indagando come i neuroni nel cervello comunicano. Molti ricercatori guardare i cambiamenti nell'attività elettrica di uno o più neuroni in risposta ad un ingresso controllato sperimentalmente. L'attività elettrica dei neuroni possono essere registrati in fettine di cervello isolato utilizzando tecniche di patch clamp con micropipette di vetro. Tradizionalmente, gli sperimentatori possono mimare ingresso neuronale con iniezione diretta di corrente attraverso la stimolazione pipetta, elettrica delle cellule o altri collegamenti assonale nella sezione o manipolazione farmacologica di recettori situati sulla membrana della cellula neuronale registrata.

    Iniezione diretta di corrente ha il vantaggio di passare una forma d'onda predeterminata corrente con elevata precisione temporale presso il sito della registrazione (di solito il soma). Tuttavia, non cambia la resistenza della membrana neuronale come canali ionici non sono fisicamente aperte. Iniezione di corrente impiega di solito impulsi rettangolari e quindi non modello la cinetica dei canali ionici. Infine, l'iniezione di corrente non può simulare i cambiamenti chimici nella cella che si verifica con l'apertura dei canali ionici.

    Recettori possono essere fisicamente attivata dalla stimolazione elettrica o farmacologica. Lo sperimentatore ha una buona precisione temporale di attivazione del recettore con la stimolazione elettrica della fetta. Tuttavia, vi è limitata precisione spaziale di attivazione del recettore e la natura esatta di ciò che viene attivata su stimolazione è sconosciuta. Quest'ultimo problema può essere parzialmente alleviati da specifici agenti farmacologici. Purtroppo, il decorso temporale di attivazione di agenti farmacologici è di solito lenta e la precisione spaziale degli ingressi sul cellulare registrato è sconosciuta.

    La tecnica del clamp dinamica consente uno sperimentatore di modificare l'attuale passato direttamente nella cella in base feedback in tempo reale del potenziale di membrana della cellula (Robinson e Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Per la revisione, si veda Prinz et al. 2004). Questo permette uno sperimentatore di imitare i cambiamenti elettrici che si verificano nel sito della registrazione in risposta all'attivazione di un recettore. Tempo reale i cambiamenti della corrente applicata sono determinati da una equazione matematica implementato in hardware.

    Abbiamo recentemente utilizzato la tecnica dinamica morsetto per indagare la generazione di raffiche di potenziali d'azione per l'attivazione fasica dei recettori NMDA nei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. In questo video, dimostriamo le procedure necessarie per applicare una conduttanza recettore NMDA in un neurone dopaminergico.

    Protocol

    1. Fetta di preparazione

    1. Tagliare fettine di cervello utilizzando un microtomo vibrante. Abbiamo preparato 240 micron fette mesencefalo orizzontale da un isoflurano-anethetized ratto Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) utilizzando un microtomo vibrante (Microm HM 650V) in conformità con l'Università del Texas a cura San Antonio degli animali e del Comitato Istituzionale Usa.
    2. Tenere le fette in una camera di incubazione fino al momento di registrare. Utilizziamo un contenitore di incubazione riscaldata a 32 ° C e riempito con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF; in mm): 126 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 2 CaCl 2, 10 destrosio, 25 NaHCO 3, 1,3 acido ascorbico, 2.4 piruvato di sodio e 0,05 glutatione.

    2. Registrazione elettrofisiologiche

    1. Trasferire la sezione per l'impianto di registrazione intracellulare in cui un fluido cerebrospinale artificiale (aCSF) a 35 ° C viene perfuso. Usiamo il aCSF stesso punto 1.2 eccetto che 2mM MgCl 2 è stato utilizzato e glutatione è stato omesso. Per fette orizzontalmente preparato, di solito dividono in due la fetta lungo la linea mediana.
    2. Visualizza il neurone bersaglio. Noi visualizzati i singoli neuroni dopaminergici della substantia nigra con un sistema di imaging gradiente di contrasto.
    3. Tirare un elettrodo con un estrattore elettronico elettrodo. Tiriamo elettrodi con una resistenza punta di 4-10 MΩ con una P97 Micropipetta estrattore (Instrument Company Sutter).
    4. Riempire un elettrodo con la soluzione desiderata interno. Noi utilizziamo una soluzione contenente (in mm): 138 K-gluconato, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. La soluzione interna è stata regolata a pH 7,3 con KOH 1M e osmolarità di 270-275 mOsms.
    5. Fare un sigillo gigaohm sul neurone desiderato. Rottura del sigillo con aspirazione. Si tratta di una registrazione a cellula intera. Un amplificatore Multiclamp 700B è stato utilizzato nella nostra configurazione. L'amplificatore dovrebbe poi essere posto in modalità morsetto corrente 'I = 0'.

    3. Applicazione della conduttanza con morsetto dinamica

    1. RTXI (www.rtxi.org) è stato eseguito sul computer morsetto dinamico. Un modello personalizzato scritta contenente un recettore NMDA è stato caricato in memoria. La corrente da iniettare nella cella in tempo reale è calcolato dalla seguente equazione:
      I NMDA =-g NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3.57) * e (-V m * 0,062))] * (V m - E NMDA) dove g è la conduttanza NMDA desiderata (in nS; di default impostato a 0 nS), [Mg] è la concentrazione di magnesio (impostata a 1,5 mm nel nostro esempio qui sotto), E NMDA è il potenziale di inversione per il recettore NMDA (impostato a 0 mV), e V m è il potenziale di membrana della cellula misurata dall'amplificatore (in millivolt).
    2. L'uscita dal computer pinza dinamico è stato collegato all'ingresso di comando dell'amplificatore tramite un convertitore analogico-digitale convertitore.
    3. L'amplificatore è stato posto in modalità morsetto corrente del 'IC'.
    4. Inserisci il tuo conduttanza desiderato recettore NMDA in RTXI (ad esempio 40ns). Si dovrebbe vedere una raffica fasica di potenziali d'azione. In alternativa, una conduttanza può essere somministrato a RTXI tramite un'uscita analogica (Figura 1A, 'g (t)'). Un fattore di scala appropriato deve essere utilizzato entro RTXI per convertire il segnale da volt a Siemens.

    4. Rappresentante Risultati

    Una configurazione di successo per l'applicazione di una conduttanza utilizzando il morsetto dinamica è mostrata in Figura 1A. Questa impostazione, abbiamo fatto un intero registrazione cellula somatica di un neurone dopaminergico nella substantia nigra pars compacta. Cellule dopaminergiche tipicamente fuoco spontaneamente a prezzi convenienti con un pacemaker-come il modello. Una raffica di potenziali d'azione può essere evocato mediante l'applicazione di una conduttanza fasica del recettore NMDA con morsetto dinamico (Figura 1B).

    Figura 1
    Figura 1: applicazione di una conduttanza recettore NMDA con la tecnica della dinamica morsetto. Configurazione hardware A. illustra le connessioni tra l'impianto di registrazione intracellulare e computer morsetto dinamico. B. Una raffica di potenziali d'azione è evocata dalla applicazione di una conduttanza 40ns recettore NMDA in una registrazione da una cellula intera substantia nigra pars compacta neurone dopaminergico.

    Discussion

    La tecnica di bloccaggio dinamico dimostrato qui migliora la tecnica tradizionale di iniezione diretta in corso, consentendo lo sperimentatore di imitare gli effetti elettrici della attivazione di un recettore. In questo video, abbiamo dimostrato che si possono aggiungere gli effetti di attivazione di un recettore NMDA per l'attività spontanea dei neuroni dopaminergici, cioè una raffica di potenziali d'azione sono evocati.

    Grazie alla flessibilità di hardware / software di implementazione, una varietà di estensioni possono essere utilizzati. Il segno della corrente iniettata può essere commutato da negativo a positivo, che rappresenta uno scenario in cui viene rimosso gli effetti del recettore attivato da un neurone. Neuroni modello, rappresentato sotto forma di una serie di equazioni differenziali, può anche essere risolto numericamente e consentire lo sperimentatore di indagare le reti di piccole dimensioni.

    Disclosures

    Nessun conflitto di interessi dichiarati.

    Acknowledgements

    Questo lavoro è stato supportato da MH084494 (CJL), e MH079276 e NS060658 (PAC).

    Materials

    Name Type Company Catalog Number Comments
    K-gluconate anhydrous Reagent Sigma-Aldrich
    HEPES Reagent Fisher Scientific
    CaCl2 X 2H2O Reagent Fisher Scientific
    Ethylene glycol-bis(B-amin–thyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid Reagent Sigma-Aldrich
    MgATP Reagent MP Biomedicals
    NaGTP Reagent MP Biomedicals
    MgCl2 Reagent Sigma-Aldrich
    NaHCO3 Reagent Sigma-Aldrich
    KCl Reagent Fisher Scientific
    NaH2PO4, Anhydrous Reagent Fisher Scientific
    Glucose Reagent Acros Organics
    NaCl Reagent Fisher Scientific
    CholCl Reagent Sigma-Aldrich
    Sodium Pyruvate Reagent Fisher Scientific
    Ascorbic Acid Reagent Acros Organics
    Glutathione Reagent Sigma-Aldrich
    Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective) Microscope Olympus Corporation
    2 A/D converters Equipment Any Supplier
    Multiclamp 700B with CV-7B headstage Equipment Molecular Devices
    P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller Equipment Sutter Instrument Co.
    Microfil syringe needles Equipment World Precision Instruments, Inc.
    Micromanipulator Equipment Siskiyou, Inc.
    Monitor Equipment Triview

    References

    1. Robinson, H.P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49, 157-65 (1993).
    2. Sharp, A.A., O'Neil M.B., Abbott, L.F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-94 (1993a).
    3. Sharp, A.A., O'Neil, M.B., Abbott, L.F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69, 992-5 (1993b).
    4. Prinz, A.A., Abbott, L.F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27, 218-24 (2004).
    5. Deister, C.A., Teagarden, M.A., Wilson, C.J., Paladini, C.A. An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting. J Neurosci. 29, 15888-97 (2009).
    6. Lobb, C.J., Wilson, C.J., Paladini, C.A. A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons. J Neurophysiol. 104, 403-13 (2010).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter