遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ

Paracchini, S., Monaco, A. P., Knight, J. C. An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations. J. Vis. Exp. (45), e2279, doi:10.3791/2279 (2010).

一般的な複雑な形質で有意な遺伝的関連の数は絶えず増加しています。しかし、これらの団体のほとんどは、分子レベルで理解されていない。表現型上のDNA変異の効果を仲介するメカニズムの一つは、複雑な形質¹の特に重要であることが示されている遺伝子発現、です。

このメソッドは、細胞のコンテキスト遺伝子発現上の特定のDNA配列の効果のテスト。原則は、疾患（リスクの亜種^）2,3に関連付けられているDNA配列のコピーを運ぶ細胞を解析、遺伝子の二つの対立遺伝子に起因する転写物の相対量を測定することです。したがって、この方法で使用される細胞は二つの基本的な遺伝子型の要件を満たす必要があります：彼らは、DNAのリスクの亜種のためにとその染色体の起源（図1）に基づいて転写産物を区別できるDNAマーカー、一般的にコーディングする遺伝子多型、両方のヘテロ接合体でなければならない。 DNAのリスクの亜種とDNAマーカーは、同じ対立遺伝子頻度を持つ必要はありませんが、遺伝子マーカーの相（haplotypic）の関係を理解し​​ておく必要があります。目的の遺伝子を発現する細胞の種類を選択することも重要です。このプロトコルは、線維芽細胞から核酸を抽出するために採用された手順のことを指しますが、この方法では、主要な細胞を含む他の細胞タイプにも等しく適用可能である。

DNAとRNAを選択した細胞株から抽出され、cDNAが生成されます。 DNAとcDNAをコードするDNAマーカー^4を対象とするように設計されたプライマー伸長アッセイで分析されています。プライマー伸長アッセイは、製造業者の仕様に従ってMassARRAY（シーケノム^）5プラットフォームを用いて行われる。プライマー伸長産物を質量分析（MALDI-TOF/MS） - 飛行のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間で分析されています。選択したマーカーがヘテロ接合体であるので、彼らはMSのプロファイル上の2つのピークが生成されます。各ピークの面積は、転写産物量に比例し、アレル比（アレル1：対立遺伝子2）生成するMassARRAYのタイパーソフトウェアの機能を測定することができる計算に。 cDNAに得られる対立遺伝子比率は対立遺伝子比が1:1の技術的なアーチファクトを補正すると予想されるゲノムDNAから測定されたものを使用して正規化されます。 1〜大幅に異なる正規化された対立遺伝子の比を有するマーカーは、表現型に関連付けられているDNA変異が遺伝子発現に影響を​​与えることを示唆し、同じセルに2つの染色体から生成された転写物の量が異なることを示している。実験的なコントロールは、結果を確認するために使用する必要があります。

1）細胞培養

1. 目的の遺伝子を発現する細胞の種類を選択してください。
2. 両方のDNAのリスクの亜種と目的の遺伝子（図1）内で転写されたコーディングの多型のヘテロ接合体細胞株を選択してください。
3. 文化サプライヤーの仕様に、それぞれDNA及びRNA抽出のために2 × 10cmペトリ皿を準備応じて選択された細胞株。
4. 細胞が80％コンフルエントに下記の手順に従ってまたは市販のキットを使ってどちらかの収穫量の細胞への手続きを開始し、DNAとRNAを単離に到達すると。

2）DNAの抽出

1. 料理からメディアを削除する、PBSで洗浄し、溶解液（0.6％SDS、100mMのNaCl、50mMトリス、20mMのEDTA、50μg/ mLのRNase Aを）の料理500μLに追加します。
2. 室温で20分間穏やかにプレートを揺らし。
3. 37℃で一晩マイクロ遠心チューブやインキュベートに細胞ライセートをこすり落とす。
4. 100μg/ mlの終濃度にプロテイナーゼKを追加し、37℃で一晩インキュベートする。
5. フェノール - クロロホルムpHを8、繰り返し、同量のDNAを抽出し、クロロホルム/イソアミルアルコールの等量を抽出する。
6. 1 / ¹⁰量の3 M NaClおよび100％エタノールを2.5倍量でDNAを沈殿させる。
7. 4℃で30分間、13,000 rpmで回転して氷上で5分間のままにして、
8. 70％エタノールでDNAを洗浄、空気乾燥し、TE200μlに再懸濁させることができます。
9. 室温で2日間に向けて出発して65℃でインキュベートする1​​0分間と。
10. 4℃-20℃または長期℃に

3）RNA抽出

1. PBSで洗い、皿からメディアを削除し、室温で10分間TRIZOLとインキュベートの1 mLを加える。
2. スクレイプの細胞は、マイクロ遠心チューブに数回、転送をピペットで5分間インキュベートする。
3. 4℃で10,000 rpmで10分間スピン℃に
4. 新しいチューブに上清を移し、クロロホルム200μLを加える。
5. 振ると4℃10,000 rpmで10分間スピン℃に
6. 新しいチューブに水相を移し、70％エタノールの等量を追加します。
7. 1または2（ボリュームに応じて）最高速度で30秒間RNeasyカラムとスピンのソリューションを読み込みます。
8. ここからRNeasyキット（キアゲン）の指示に従ってください。

4）核酸試料の調製

1. 光度計分光光度計（Thermo Scientific社）を用いてDNAとRNAの濃度を定量化する。
2. 製造元の指示に従ってランダムdecamersとのSuperScript III逆転写酵素（Invitrogen）を用いてRNAの500から1000 ngからcDNAを準備します。

5）PCRとプライマー伸長アッセイ

1. 各DNAマーカーのためのPCRプライマーの設計つのペアを、ゲノムDNAの増幅とcDNAの増幅（ 図2）のための他のペアに対して1つのペア。前方に配置し、ゲノムの混入を避けるために、異なるエクソンにcDNAの増幅用のプライマーを逆に。 100から500 bpの長さの範囲でPCR産物を得るための設計プライマー。
2. 0.5 U Immolase Taqポリメラーゼ（Bioline）0.8 mMのdNTPsを、2mMのMgCl _2、0.2Mの各プライマーとcDNAまたはDNAのいずれかの20ngのを含む10μLのPCR反応を準備する。つの独立した反応で各サンプルを増幅する。
3. 増幅の線形位相でサイクル数を保ち、各プライマーのペア用に最適化された条件下でのPCR反応を実行します。
4. エキソヌクレアーゼでPCR産物を培養することにより過剰なPCRプライマーおよびdNTPを除去する私、37でエビアルカリホスファターゼ（SAP）℃で20分間。
5. 8測定は各サンプルに対して使用可能になるように、384ウェルプレートに二回、各PCR産物を見つける。
6. 同じプライマーがゲノムおよびcDNAの両方のPCR産物のために使用できるように、アッセイデザイン（シーケノム）ソフトウェアと拡張子のプライマーを設計します。 3ddNTPsの組み合わせ（図2）を含めて14から18塩基対と拡張ミックスの範囲内にプライマーの長さを指定します。
7. メーカーの指示に従ってMassARRAYシステム（シーケノム）を使用して、プライマー伸長反応とMALDI-TOF/MS分析を行う。
8. 典型的なプライマー伸長反応は94℃で開始するステップ℃で2分間、5秒、52℃で5秒と72℃、94℃の40サイクルが続く5秒のために含まれています
9. プライマー伸長産物はSpectroCLEAN樹脂を用いて洗浄し、SpectroPOINTナノリットルディスペンサーによるマイクロアレイ（チップ）上に転写されています。
10. 拡張されたオリゴヌクレオチドはMALDI - TOFはSpectroREADER質量分析計を用いて定量化されています。

6）統計解析

1. 実験の一般的な品質のためのMassARRAYのタイパーソフトウェアとのMALDI-TOF/MSの結果を確認してください。
2. ピーク面積のデータを含むアレロタイプ化のレポートを抽出します。
3. 個々のスペクトルで計算アレル1およびアレル2のピーク面積（ピーク面積比）の比率。
4. 各cDNAサンプルは8測定を越え、Excelで対応する関数を使用して、ピーク面積比の平均値と標準偏差を導出する。
5. ゲノムDNAのための8 measurmentsで同じ平均ピーク面積比を求めよ。
6. 予想される1:1の比率に偏差を評価するためにゲノムの平均の比によりcDNAの平均比率を割ります。

7）実験のコントロール

1. 実験的なアーティファクトを除外するために、少なくとも3回の実験を繰り返す。
2. 追加のDNAマーカーの可能な限り、設計のアッセイ。
3. 順方向および逆方向の両方の鎖にアニーリング複数のPCRのプライマーペアと拡張子のプライマーを設計します。
4. 可能な限りのDNAマーカーのヘテロ接合体であるが表現型に関連付けられているDNAのリスクの亜種を運ぶしないネガティブコントロールの細胞株などのテスト（図1及び図3）

8）代表の結果

アレル特異的発現解析の例は、質量分析のトレースの例を図3に示します。図は、4つの異なるテンプレートで実施4対立遺伝子特異的プライマー伸長産物の分析結果を示しています。上部のグラフは、転写されたコーディングの多型についてヘテロ両方とも二つの異なる細胞株のゲノムDNAの解析から得られた結果を表します。しかし、唯一の細胞株は、リスクのDNAの変異体（図1）のヘテロ接合体である。下のグラフは、同じ細胞株から生成されたcDNAの解析から得られた結果を表します。実験的なアーティファクトの結果として、最初のピークは常にさえゲノム分析の第2ピークよりも高いです。そのため、ゲノム解析の結果を、cDNAのデータを正規化するために使用されます。正規化した後、アレル比は細胞株で1から有​​意に異なっている（第二のピークは他のスペクトルに比べて低く表示される場所）、データはそのセルの行を示唆B.それは、細胞株では1に非常に近いしている間には大電流が流れる解析で遺伝子の発現を減少させる番目のピークで測定された対立遺伝子との相におけるDNAの変異、。セルラインBは、非常に便利な負の制御を提供します。

図1。細胞株の選択の戦略。細胞株とBのリスクのDNAバリアント（丸）のヘテロ接合体である転写コーディングマーカー（三角形）だけ細胞株に対してヘテロ接合されています。リスクバリアントの青対立遺伝子は、転写レベルが低いと（実際の機能的変異体との密接な相関関係に直接的な影響を持つため、またはどちらか）られています。

図2。対立遺伝子特異的プライマー伸長アッセイ。この図は、cDNA（左）とゲノムDNA（右）テンプレートの両方を搭載し、実験手順の作業の流れを示す。 PCRプライマーは（灰色の長方形）ヘテロ接合体をコードする多型（三角形）を増幅するように設計されています。ゲノムコンタミネーションPCRプライマーは、増幅はcDNAを鋳型に行われている異なるエクソン（水色のバー）に配置されたシーケンスをアニール避けるために。 PCR産物は、多型の隣に一つの基地をアニーリング、エクステンションのプライマーを用いて行ったプライマー伸長反応の鋳型として使用され、3つのジデオキシヌクレオチドの適切な組合せ（ddNTPsは）ターミネーター（四角）一デオキシヌクレオチド（円が）延長にそれぞれ1つまたは2つの基礎の入門書。結果として得られるプライマー伸長産物はMALDI - TOF質量分析法による分離と定量化を可能にするさまざまな質量を持っている。 DNAマーカーの青対立遺伝子に対応する製品の量は、赤対立遺伝子の相対的に低くなります。

図3。対立遺伝子特異的発現アッセイの結果。図は、分析から質量分析の結果は、ゲノムDNAと細胞株のcDNAおよび細胞株のB（図1）で実施を示す。

このメソッドは、in vivoでの対立遺伝子特異的転写レベルの違いで評価することによって、遺伝子発現に疾患関連のDNA変異体の効果の評価が可能になります。このプロトコルでは相対的な転写産物量はMALDI - TOFが、そのようなのTaqMan ^6,7などのアレル特異的定量を、許可する他の技術によって測定され、使用することができます。このアプローチの主要な制限は、転写されたコーディングマーカーの可用性です。原理に基づく方法はここで説明するが、多型の異なるクラスを利用して、記載されている。 haploChipアッセイ対策の対立遺伝子特異的ポリメラーゼII ^8を RNAに特異的な抗体で分離したクロマチン免疫沈降された物質中に存在するであろう遺伝子の転写開始点または終了点のサイトの1 kb以内に位置するマーカーを用いて表現。鋳型がRNA ⁹異種の場合に別の方法として、イントロンのSNPは、使用することができます。

特定のプロトコルは、haploChipアッセイと組み合わせて、ここで説明した失読症（または障害を読み込む）するための候補遺伝子を同定するために成功裏に使用されています。最初に遺伝的関連の研究では、失読症とつの遺伝子^10をスパニングされたに関連付けられているDNA配列を同定した。対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイは、失読症関連DNA変異の発現変動の存在下で3つの遺伝子の一方のみが観察ではなく、他の二つの^11歳のことを示した。

利害の衝突は宣言されません。

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