蠕虫病毒实验室介绍：从培养蠕虫突变

第1部分：准备线虫的生长介质（NGM）的Petri板

实验线虫， 如线虫和 P. pacificus通常在6厘米的Petri板含有线虫的生长介质^（NGM）1实验室培养。蠕虫是保持在20 ° C，但可以根据线虫的物种和实验设计，在一定温度范围内（4 ° C - 25 ° C之间）孵育。为了准备与NGM板，标准的无菌技术已被用来防止真菌和细菌的污染。以下是协议准备NGM板：

1. 称取蛋白胨2克，琼脂15克，2.4克氯化钠2.72克KH _{2 PO} 4 2升锥形瓶中，使体积至1 L与水，高压灭菌器，并允许它冷却到60 ° C水浴中。
2. 添加0.8毫升的1 M _氯化钙 ，胆固醇（5毫克/毫升乙醇中），1米_硫酸镁 。为了防止真菌和细菌的污染，1 ml链霉素（100毫克/毫升）和1毫升制霉菌素（10毫克/毫升），可以被添加到每公升介质。
3. 使用Unispense机和保持无菌条件下，倒入所需的板媒体。板应装到约2 / 3 ^路 。一个标准的直径为60毫米的钢板，需要约10毫升的媒体。不要板块移动，直到琼脂完全gelified，否则会有琼脂表面凹凸不平，使其难以集中的体视显微镜上的蠕虫。
4. 一旦干燥，板材可立即接种或储存在4℃，直至与细菌播种彗星。

第2部分：准备OP50细菌和播种NGM的Petri板

P. pacificus是在实验室培养大肠杆菌 OP50应变喂养。 OP50上NGM板的有限增长，从而形成一个薄的草坪，方便的可视^化的蠕虫1。要成长的OP50文化，使用LB -肉汤：

1. 添加5克，2.5克酵母提取物和2.5 g氯化钠bactotryptone螺丝帽瓶500毫升，用蒸馏水和高压灭菌容至500 ml。
2. 同一个OP50单菌落接种肉汤的无菌条件下培养板，让它成长一夜之间在37 ° C。
3. LB - OP50是随时可以使用，可以储存在4 ° C几个月，如果保持无菌。每当种子板块需要无菌一个小烧杯，倒入少量的肉汤，这将有助于防止污染的股票文化。
4. 种子板，分配到60毫米直径的NGM的Petri板和漩涡传播的OP50 100-120μL。
5. 孵育这些种子草坪生长板在室温下过夜。这些种子的板，现在可以存储长达3个星期在4 ° C。它们存储在一个倒置的位置，有助于防止快速干燥。

第3部分：一挑

在本节中，我们介绍了如何挑一个蠕虫。挑用于蠕虫从一个位置转移到另一个。挑30计90％的铂金10％铱丝，虽然一些研究人员可能更喜欢稍有不同的金属成分：

1. 剪下约3-4厘米的导线，巴斯德吸管（其尖端被打破到一个较小的长度）的提示，然​​后0.5厘米内入玻璃密封在一个本生灯。从玻璃突起线的长度大约是3-3.5厘米，但可以根据个人喜好而有所不同。
2. 拼合线是凸出使用锤子或钳子的结束。然后夷为平地的部分向上弯曲，形成了瓢。
3. 用沙纸，以防止破坏性的蠕虫或琼脂，理顺拿起锋利的边缘。

第4部分：采摘蠕虫

1. 挑蠕虫，火焰消毒的铂丝和拖细菌草坪扁平尖挑大衣与稠粘细菌的一角，小心不要穿刺或损坏的琼脂表面。
2. 使用立体显微镜，很轻轻一刷直到蠕虫被拾起棍子上挑的细菌的蠕虫病毒/蠕虫对粘提示。
3. 一旦蠕虫的挑尖，转移它立即到新盘，通过触摸或滑动的挑尖对新盘的细菌草坪和蠕虫抓取。必须小心不损坏板面的琼脂，其他的蠕虫爬进孔，使其难以检索。如果蠕虫停留挑太久，它可能变干。

第5部分：EMS诱变

乙基甲烷磺酸盐（EMS）诱导突变在基因组中的2的广谱。突变体可以识别的缺陷，如产蛋，肌肉缺损S，性别决定的dauer形成，行为，和性腺形成。为EMS诱变的协议是类似的 C描述线虫 ^1。

1. 准备500毫升1N氢氧化钠（或更多）。
2. 需4-5，直径6厘米的Petri板的蠕虫病毒，其中包含几百蠕虫幼虫少年第三阶段（J3），洗掉的蠕虫使用2-3毫升无菌每盘M9。
3. 在无菌的，一次性的15毫升离心管收集的所有的蠕虫。离心5-7分钟，或在1500 XG直到蠕虫形成一个颗粒。
4. 吸出液体，并用2毫升M9的重新暂停蠕虫。 M9的一个试管中2毫升添加20μL的环境管理体系和动摇解散。然后，添加这种蠕虫悬挂和漩涡轻轻2毫升EMS解决方案。 EMS的终浓度为47毫米。注意：EMS是一个非常强烈的诱变剂，并应在通风橱中处理。在这个诱变剂接触的所有材料（手套，滴管，提示），应被视为与1N氢氧化钠不活跃的EMS。双层手套穿在整个EMS诱变过程。根据您的机构的指导方针，处置危险废物的。
5. 将离心管中，并用封口膜覆盖的上限;水平放置在通风柜，让孵育3.5小时的蠕虫。管也可以放在低速摇臂。
6. 打开管，并用封口膜覆盖的上限;蠕虫下沉的垂直位置，直到孵化的地方。
7. 吸出上清液，并丢弃到一个烧杯/烧瓶中含有1N氢氧化钠。这将可灭活该环境管理体系。
8. 加入5毫升M9的蠕虫，倒置管的25-30倍，洗5-7分钟，或蠕虫，离心机在1500 XG直到蠕虫形成一个颗粒。吸出上清液，并丢弃到1N氢氧化钠烧杯。
9. 重复至少3次洗涤步骤。
10. 最后一次洗涤后，重新暂停少量的M9（〜500μL）的蠕虫病毒颗粒，并滴入含有OP50细菌草坪的NGM板出来。在这一点上，你不再需要工作在化学罩。
11. 让液体干燥几分钟，然后挑选健康的J4的幼虫转移到新鲜的种子板块。根据您所在机构的危险废物准则丢弃原板。
12. 让诱变蠕虫自我受精。使用立体显微镜下，屏幕上的F2代表型为隐性突变体的利益。

第6部分：补骨脂素诱变

在本节中，我们描述了长波长紫外线（UV）一起使用TMP的突变过程。 TMP /紫外线诱变的方法被广泛用于诱导缺失突变在基因^组 3 。

1. 4-5，直径6厘米的Petri板收集到15 mL离心管前面介绍的步骤中的蠕虫病毒。
2. 添加10毫升M9的反转20次，在1500 XG洗5分钟的蠕虫和离心机。弃上清，重复洗涤，共3次。吸出液体和重新暂停在10倍左右，M9的体积含有30微克/毫升的TMP的蠕虫。吸取20μL到2毫升M9的TMP（3毫克/毫升）。环境管理体系一样，TMP是一种强力致癌物质，必须采取适当的安全措施来处理。为了防止在紫外线照射下正确的眼睛穿的潜在风险，应使用。必须在适当的生物危害袋被丢弃的一次性。
3. 在黑暗中孵育15分钟的低转速的摇杆（40芬欧）在室温下管。设置覆盖的管垂直为10分钟，让所有的蠕虫下沉。
4. 从巴斯德吸管管的底部取出蠕虫和它们转移到一个非种子选手NGM板。丢弃以下机构的危险化学品的指引上清。
5. 保持在暗盘，直到多余的川芎嗪板吸收。
6. 使用紫外线强度计，设置之间的长波紫外线源的距离和钢板等，对钢板的强度是500微^瓦 / ^平方厘米4。删除铝盖，盖，盖，板，含有50秒川芎嗪治疗蠕虫的长波紫外线辐射暴露。
7. 盖，在室温下5小时，在黑暗中的蠕虫。
8. 挑选和健康的J4的幼虫转移到新鲜的种子板块。丢弃以下机构的危险化学品的指引的原板。
9. 使用立体显微镜，屏幕F2代利益的突变表型。

第7部分：代表结果

一些在体育pacificus（可以通过EMS或TMP /紫外线）诱变产生的突变表型，如图1所示。每个突变体具有特征性的的表型，野生型动物，很容易分辨。从蠕虫被处理的诱变剂，30 J3/J4从亲代（P0）的幼虫被放置在单独的板块，并让其产卵，这是F1代。从板块表现出健康的F1子代，共1000 F1S被转移到个别板块和F2代表型的筛选。矮胖^5,6，不协调⁶和变压器⁷表型的动物被发现。

图1。Pristionchus pacificus野生型和突变型的动物。 A. WT雌雄同体B. WT男三DPY突变D。 UNC突变E. TRA突变。前两名面板显示野生型雌雄同体（左）和男（右）的动物，在余下的面板不同的突变体进行比较。

突变是一个广泛采用的技术，在各种实验模式生物基因研究。通常用于突变实验，以确定一个基因的²的功能。这里所描述的突变程序可以使用，不仅为体育pacificus，但也为C。线虫和其他相关线虫物种。在这里，我们介绍两种方法，环境管理体系和TMP /紫外线诱变。

EMS是一种化学物质，诱导点突变或整个基因组的^3,8小缺失。补骨脂突变（TMP / UV）主要诱发原因可能断裂，在紫外线照射下引起的DNA缺失突变。删除片段通常在长度为³ kb的范围为0.10至15。

我们筛选的表型是比较常见的找到。在屏幕使用EMS F2动物每400板块，一个板块一个DPY，UNC或茶。 DPY可确认其异常运动和茶，有一个男的表型和XX染色体^核型7 ^短尺寸7日，联合国军司令部。 TMP /紫外线诱变的产生与环境管理^体系 3相比，突变体的频率较低，但它会产生更大的缺失。

线虫，第四阶段后期幼虫或年轻成人是最有效的的发展阶段，因为他们有生殖线核的最大数量进行诱变。因此，它是有用的，开始第四阶段的幼虫许多家长人口与同步的实验。一个简单的方法是同步文化与鸡蛋，而不是成虫新的文化。在下面的一代，大多数蠕虫将大约在同一时代。隐性突变，可以检测到通过检查F1个人，这将产生约百分之二十五个纯合子的后代。

可进一步利用线虫的基因屏幕上的权力，通过^修改设计的屏幕9。雌雄同体的生活方式和快速生成时间相结合，使线虫的遗传学研究的理想之选。