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इल्ली लैब के लिए एक परिचय: संवर्धन कीड़े से mutagenesis

*, *,

Department of Biology, University of Texas at Arlington

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Cite this Article: इल्ली लैब के लिए एक परिचय: संवर्धन कीड़े से mutagenesis

Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293, doi:10.3791/2293 (2011).

Abstract: इल्ली लैब के लिए एक परिचय: संवर्धन कीड़े से mutagenesis

इस प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए प्रयोगशाला में और कैसे उन्हें दो वैकल्पिक तरीकों का उपयोग कर mutagenize नेमाटोड बनाए रखने: एथिल मीथेन sulfonate (ईएमएस) और 4, 5 ', 8-trimethylpsoralen पराबैंगनी प्रकाश / tmp (यूवी) के साथ संयुक्त. नेमाटोड क्योंकि उनके शरीर सरल योजना और संभोग प्रणाली, जो स्वयं fertilizing hermaphrodites और पुरुषों है कि जानवर प्रति संतान के सैकड़ों उत्पन्न कर सकते हैं की रचना की है के शक्तिशाली आनुवांशिकी अध्ययन के लिए जैविक प्रणालियों रहे हैं. नेमाटोड अगर जीवाणुओं की एक लॉन युक्त प्लेटों में रखा जाता है और आसानी से एक थाली से एक लेने का उपयोग दूसरे करने के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं. ईएमएस एक alkylating एजेंट आमतौर बिंदु म्यूटेशनों और छोटे विलोपन प्रेरित किया है, जबकि मुख्य रूप से / tmp यूवी विलोपन लाती है. निमेटोड की प्रजातियों में इस्तेमाल किया जा रहा है पर निर्भर करता है, ईएमएस और TMP सांद्रता के लिए अनुकूलित किया जाना होगा. निमेटोड Pristionchus pacificus के पीछे हटने का परिवर्तन को अलग करने के लिए, F2 पीढ़ी के पशुओं नेत्रहीन phenotypes के लिए जांच की गई. इन तरीकों का उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, हम कीड़े mutagenized और बेबुनियाद (UNC), (Dpy) गठीला और ट्रांसफार्मर म्यूटेंट (Tra) के लिए देखा.

Protocol: इल्ली लैब के लिए एक परिचय: संवर्धन कीड़े से mutagenesis

भाग 1: तैयारी निमेटोड विकास मीडिया (एन जी एम) पेट्री प्लेटें

सी एलिगेंस और पी. जैसे प्रायोगिक नेमाटोड pacificus आमतौर पर 6 सेमी पेट्री निमेटोड ग्रोथ (एन जी एम) मध्यम 1 युक्त प्लेटों पर प्रयोगशाला में संवर्धित कर रहे हैं. कीड़े 20 ° C में रखा जाता है, लेकिन तापमान की एक सीमा (4 ° सी - 25 डिग्री सेल्सियस के बीच) में incubated जा सकता है, निमेटोड प्रजातियों और प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है. एन जी एम के साथ प्लेटें तैयार करने के लिए, मानक बाँझ तकनीक फंगल और बैक्टीरियल संदूषण रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा है. एन जी एम प्लेटें तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल है:

  1. 15 ग्राम अगर, 2.4 ग्राम NaCl, 2 जी Tryptone, और 2.72 ग्राम के.एच. 2 4 पीओ 2 एल शंक्वाकार फ्लास्क में, मात्रा बनाने के साथ पानी, आटोक्लेव एल 1 और यह 60 ° सी एक पानी के स्नान में शांत करने के लिए अनुमति देते हैं वजन.
  2. 0.8 मिलीलीटर 1 एम 2 CaCl के प्रत्येक, कोलेस्ट्रॉल जोड़ें (5 मिलीग्राम / इथेनॉल में मिलीलीटर), और 1 एम MgSO 4. मध्यम के प्रत्येक लीटर फंगल और बैक्टीरियल संदूषण, 1 मिलीलीटर (100 मिलीग्राम / एमएल) स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1ml Nystatin (10 मिलीग्राम / एमएल) को रोकने जोड़ा जा सकता है.
  3. Unispense मशीन का प्रयोग और बाँझ शर्तों को बनाए रखने, वांछित प्लेटों में मीडिया डालना. प्लेटें 2 / 3 के बारे में तीसरी भरा से भरा होना चाहिए. एक मानक 60 मिमी व्यास की थाली मीडिया के बारे में 10 मिलीलीटर की आवश्यकता है. हिलना नहीं जब तक पूरी तरह से अगर gelified है प्लेटें, अन्यथा वहाँ अगर के एक असमान सतह हो सकता है, यह stereomicroscope पर मुश्किल कीड़े का ध्यान केंद्रित करने के लिए बना.
  4. एक बार सूखे, प्लेटें तुरंत वरीयता प्राप्त किया जा सकता है या संग्रहीत 4 बजे ° C बैक्टीरिया के साथ बीज बोने की क्रिया जब तक.

भाग 2: OP50 बैक्टीरिया की तैयारी और बोने एन जी एम पेट्री प्लेटें

पी. pacificus प्रयोगशाला में ई. कोलाई OP50 तनाव पर खिला द्वारा संवर्धित है. OP50 एन जी एम प्लेटों पर एक सीमित विकास किया है, जिससे एक पतली लॉन कि एक कीड़े के दृश्य की सुविधा के गठन. OP50 की संस्कृति के विकास के लिए, लेग बाइ शोरबा का उपयोग करें:

  1. 5 छ bactotryptone, 2.5 छ खमीर निकालने और 2.5 छ NaCl 500 मिलीलीटर पेंच टोपी बोतल आसुत जल और आटोक्लेव के साथ मात्रा 500 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. OP50 की एक कॉलोनी के साथ बाँझ शर्तों के तहत संस्कृति की थाली से शोरबा टीका लगाना और यह 37 पर रातोंरात बढ़ने डिग्री सेल्सियस
  3. OP50-लेग के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है और 4 बजे ° कई महीनों के लिए सी में संग्रहीत किया जा सकता है अगर बाँझपन बनाए रखा है. जब भी प्लेटों के लिए वरीयता प्राप्त करने की आवश्यकता है, एक छोटे से बाँझ बीकर में शोरबा की एक छोटी राशि डाल और यह शेयर संस्कृति के संक्रमण को रोकने में मदद मिलेगी.
  4. बीज प्लेटों के लिए, 60 मिमी व्यास एन जी एम पेट्री प्लेट और यह फैल ज़ुल्फ़ पर OP50 के 100-120 μl बग़ैर.
  5. इन वरीयता प्राप्त लॉन विकसित करने के लिए कमरे के तापमान पर रातोंरात प्लेटें सेते हैं. ये वरीयता प्राप्त प्लेटें अब 4 ° C में संग्रहीत करने के लिए 3 सप्ताह के लिए किया जा सकता है. उन्हें एक औंधा स्थिति में भंडारण तेजी से सुखाने को रोकने में मदद करता है.

भाग 3: एक पिकअप बनाना

हम इस अनुभाग में वर्णन कैसे कीड़े के लिए एक लेने के लिए. लेने के लिए एक स्थान से दूसरे करने के लिए कीड़े हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. लेने 30 गेज 90% प्लैटिनम 10% iridium तार से बना है, हालांकि कुछ शोधकर्ताओं थोड़ा अलग धातु रचनाओं को पसंद कर सकते हैं:

  1. तार के 3-4 सेमी के बारे में काटें, जगह एक पाश्चर विंदुक (जिसका टिप एक छोटी लंबाई को तोड़) के टिप, और तब के अंदर 0.5 सेमी इसे का गिलास में एक Bunsen बर्नर पर इसे सील. कांच से फैला हुआ तार की लंबाई के बारे में 3-3.5 सेमी है, लेकिन व्यक्तिगत वरीयताओं के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.
  2. तार के अंत है कि एक हथौड़ा या सरौता का उपयोग कर फैला हुआ है समतल. फिर चपटा भाग ऊपर की ओर मोड़ करने के लिए एक स्कूप फार्म.
  3. कीड़ा या अगर हानिकारक को रोकने के लिए एक रेत कागज के साथ लेने के तेज किनारों के smoothen.

भाग 4: उठा कीड़े

  1. कीड़े लेने के लिए, एक लौ पर प्लैटिनम तार बाँझ और बैक्टीरियल लॉन के साथ लेने के चपटा टिप मोटी चिपचिपा बैक्टीरिया के साथ टिप कोट करने के लिए खींचें, पंचर या अगर सतह को नुकसान के लिए देखभाल नहीं ले रही.
  2. Stereomicroscope का प्रयोग, बहुत हल्के / कीड़ा तक कीड़ा लेने पर बैक्टीरिया पर चिपक जाती है उठाया जा कीड़े के खिलाफ चिपचिपा टिप ब्रश.
  3. एक बार कीड़ा लेने की नोक पर है, यह तुरंत छूने या नई प्लेट के जीवाणु लॉन के खिलाफ लेने की नोक फिसलने से नई प्लेट हस्तांतरण, और कीड़ा बंद क्रॉल चाहिए. थाली पर अगर की सतह को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए और कीड़े यह मुश्किल के लिए उन्हें पुनः प्राप्त करने के लिए बनाने के छेद में क्रॉल. यदि कीड़ा भी लंबे समय के लिए लेने पर रहता है, यह कुम्हलाना हो सकता है.

भाग 5: ईएमएस mutagenesis

इथाइल मीथेन sulfonate (ईएमएस) के जीनोम में 2 में एक परिवर्तन के एक व्यापक स्पेक्ट्रम लाती है. म्यूटेंट अंडे बिछाने, मांसपेशियों दोष की तरह दोष द्वारा पहचाना जा सकता है हैएस, लिंग निर्धारण, dauer गठन, व्यवहार, और जननपिंड गठन. ईएमएस mutagenesis के लिए प्रोटोकॉल सी. के लिए वर्णित है कि समान है 1 एलिगेंस.

  1. 1N NaOH के 500 मिलीलीटर (या अधिक) तैयार करें.
  2. 4-5 लो, 6 सेमी व्यास पेट्री कीड़े का भरा प्लेटें, तीसरे लार्वा (J3) किशोर मंच पर एक कुछ सौ कीड़े युक्त और प्लेट प्रति बाँझ M9 के 2-3 मिलीलीटर का उपयोग बंद कीड़े धोने.
  3. एक बाँझ, डिस्पोजेबल 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सभी कीड़े लीजिए. 5-7 मिनट के लिए या 1500 XG पर अपकेंद्रित्र है जब तक कीड़े एक गोली फार्म.
  4. तरल Aspirate और फिर निलंबित कीड़े M9 के 2 मिलीलीटर का उपयोग करें. M9 के 2ml युक्त ट्यूब के लिए 20 μl ईएमएस जोड़ें और इसे भंग हिला. फिर इस ईएमएस कीड़ा निलंबन और ज़ुल्फ़ धीरे 2ml का हल जोड़ें. ईएमएस के अंतिम एकाग्रता 47 मिमी जाएगा. सावधानी: ईएमएस एक बहुत मजबूत उत्परिवर्तजन है और एक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए. सब (दस्ताने, pipettes, सुझावों) सामग्री है कि इस उत्परिवर्तजन के साथ संपर्क में आने 1N NaOH साथ निष्क्रिय ईएमएस करने के लिए इलाज किया जाना चाहिए. पूरे ईएमएस mutagenesis प्रक्रिया के दौरान डबल दस्ताने पहनें. अपनी संस्था के दिशा निर्देशों के अनुसार खतरनाक कचरे के निपटान.
  5. अपकेंद्रित्र ट्यूब प्लेस और parafilm साथ टोपी कवर, यह धूआं हुड में क्षैतिज और जगह 3.5 घंटे के लिए सेते कीड़े चलो. ट्यूब भी एक कम गति घुमाव पर रखा जा सकता है.
  6. ट्यूब मुड़ें और parafilm साथ टोपी कवर, ऊर्ध्वाधर स्थिति और कीड़े सिंक तक सेते में जगह.
  7. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और यह एक बीकर / 1N NaOH युक्त कुप्पी में त्यागें. यह ईएमएस निष्क्रिय होगा.
  8. कीड़े को 5 मिलीलीटर M9 जोड़ें, ट्यूब 25-30 बार पलटना करने के लिए 5-7 मिनट के लिए या 1500 XG पर कीड़े, अपकेंद्रित्र है जब तक कीड़े एक गोली फार्म धोने. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 1N NaOH बीकर में त्यागें.
  9. धोने कदम कम से कम 3 बार दोहराएँ.
  10. अंतिम धोने के बाद, M9 की न्यूनतम राशि (~ 500 μl) में कृमि गोली फिर से निलंबित और एन जी एम OP50 जीवाणुओं की एक लॉन युक्त प्लेटों पर उन्हें बाहर विंदुक. इस बिंदु पर आप अब कोई रासायनिक हुड में काम करने की जरूरत है.
  11. कुछ मिनट के लिए सूखी तरल चलो और फिर लेने और ताजा वरीयता प्राप्त प्लेटें के लिए स्वस्थ लग J4 लार्वा हस्तांतरण. अपनी संस्था के खतरनाक अपशिष्ट के दिशा निर्देशों के अनुसार मूल थाली त्यागें.
  12. चलो mutagenized कीड़े आत्म खाद. एक stereomicroscope का प्रयोग, ब्याज के पीछे हटने म्यूटेंट के लिए F2 पीढ़ी phenotypes स्क्रीन.

भाग 6: Psoralen mutagenesis

इस अनुभाग में हम लंबी तरंगदैर्य पराबैंगनी (यूवी) के साथ संयोजन के रूप में TMP का उपयोग mutagenesis के लिए प्रक्रिया का वर्णन. Mutagenesis की विधि / tmp यूवी व्यापक रूप से एक जीनोम के भीतर 3 विलोपन म्यूटेशनों प्रेरित किया है.

  1. एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र जैसा कि पिछली कार्यविधि में वर्णित ट्यूब में 4-5, 6 सेमी व्यास पेट्री प्लेटों से कीड़े लीजिए.
  2. 10 मिलीलीटर जोड़ें M9, 20 बार पलटना XG 1500 में 5 मिनट के लिए कीड़े, और अपकेंद्रित्र धो. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 3 बार के एक कुल के लिए वाशिंग दोहराने. Aspirate तरल और के बारे में 10 बार M9 के अपने मात्रा 30 μg / TMP मिलीलीटर युक्त में कीड़े फिर से निलंबित. पिपेट TMP μl M9 के 2 मिलीलीटर में 20 (3 मिलीग्राम / एमएल). ईएमएस की तरह, TMP एक शक्तिशाली कैसरजन है और उचित सुरक्षा उपायों के संभाला जाना चाहिए. यूवी प्रकाश उचित आंख पहनता के संभावित खतरे से रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. disposables उचित biohazard बैग में खारिज किया जाना चाहिए.
  3. अंधेरे में एक कम गति घुमाव (40 UPM) पर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब को सेते हैं. कवर ट्यूब खड़ी सेट 10 मिनट के लिए सभी कीड़े सिंक जाने के लिए.
  4. पाश्चर विंदुक के साथ ट्यूब के नीचे से कीड़े निकालें और उन्हें एक गैरवरीय एन जी एम थाली पर स्थानांतरण. अपनी संस्था के खतरनाक रासायनिक दिशा निर्देशों का पालन सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  5. अंधेरे में प्लेट रखें जब तक अतिरिक्त TMP थाली में लीन है.
  6. एक यूवी तीव्रता मीटर का प्रयोग, लंबी लहर यूवी स्रोत और ऐसे प्लेट के बीच की दूरी है कि थाली पर तीव्रता 500 / μW सेमी 4 2 सेट. एल्यूमीनियम कवर और ढक्कन हटाएँ और कवर और दीर्घ तरंग पराबैंगनी विकिरण के लिए 50 सेकंड के लिए TMP इलाज कीड़े युक्त थाली का पर्दाफाश.
  7. कवर और कमरे के तापमान पर 5 घंटे के लिए अंधेरे में कीड़े छोड़.
  8. उठाओ और ताजा वरीयता प्राप्त प्लेटें के लिए स्वस्थ लग J4 लार्वा हस्तांतरण. अपनी संस्था के खतरनाक रासायनिक दिशा निर्देशों का पालन मूल थाली त्यागें.
  9. एक stereomicroscope का प्रयोग, ब्याज के उत्परिवर्तन के लिए F2 पीढ़ी phenotypes स्क्रीन.

भाग 7: प्रतिनिधि परिणाम

पी. के कुछ pacificus उत्परिवर्ती mutagenesis (ईएमएस TMP / या यूवी के द्वारा या तो) से जिसके परिणामस्वरूप phenotypes चित्र 1 में दिखाया जाता है. प्रत्येक उत्परिवर्ती एक विशेषता phenotype है कि आसानी से जंगली प्रकार पशु से अलग पहचाना है. कीड़े सेकि उत्परिवर्तजन, माता - पिता की पीढ़ी (P0) से 30 J3/J4 लार्वा अलग प्लेट में रखा गया और अंडे, जो F1 पीढ़ी के हैं रखना की अनुमति दी के साथ इलाज किया गया. प्लेटों से है कि स्वस्थ F1 संतान दिखाया कुल 1000 F1s व्यक्तिगत प्लेटों को स्थानांतरित कर दिया गया और F2 संतान phenotypes के लिए दिखाई गई. उदासी 5,6, 6 बेबुनियाद और ट्रांसफार्मर 7 phenotypes साथ पशु पाए गए.

चित्रा 1
चित्रा 1 Pristionchus pacificus जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती पशुओं. ए wt उभयलिंगी बी wt पुरुष सी. dpy उत्परिवर्ती डी. UNC उत्परिवर्ती ई. टीआरए उत्परिवर्ती. शीर्ष दो जंगली प्रकार (बाएं) उभयलिंगी और पुरुष जानवरों (दाएं) दिखा शेष पैनल में विभिन्न म्यूटेंट के साथ तुलना पैनलों.

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Discussion: इल्ली लैब के लिए एक परिचय: संवर्धन कीड़े से mutagenesis

Mutagenesis विभिन्न प्रयोगात्मक मॉडल जीवों में आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से कार्यरत तकनीक है. Mutagenesis प्रयोगों अक्सर समारोह के लिए एक 2 जीन की पहचान के लिए उपयोग किया जाता है. mutagenesis यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं न केवल पी. के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है pacificus, लेकिन यह भी सी. के लिए एलिगेंस और अन्य संबंधित निमेटोड प्रजातियों. यहाँ हम दो तरीकों, ईएमएस और TMP / यूवी mutagenesis का वर्णन करता है.

ईएमएस एक रसायन है कि बिंदु या परिवर्तन छोटे विलोपन 3,8 जीनोम भर लाती है. Psoralen mutagenesis (TMP यूवी /) ज्यादातर संभव पराबैंगनी प्रकाश से प्रेरित टूटना के कारण डीएनए में विलोपन म्यूटेशनों लाती है. विलोपन टुकड़े 3 लंबाई में 0,10 करने के लिए 15 केबी की रेंज में आम तौर पर कर रहे हैं.

हम phenotypes कि खोजने के लिए अपेक्षाकृत आम हैं के लिए जांच की. ईएमएस, F2 जानवरों के साथ प्रत्येक 400 प्लेटों के लिए, का उपयोग कर स्क्रीन के बारे में एक थाली में एक Dpy, UNC या Tra था. Dpy अपनी असामान्य 6 आंदोलन और Tra के लिए अपने छोटे आकार 7, UNC के किया जा सकता है एक पुरुष phenotype और एक XX 7 karyotype होने के लिए मान्यता प्राप्त है. TMP / यूवी mutagenesis 3 ईएमएस तुलना म्यूटेंट पैदा करने का एक कम आवृत्ति है, लेकिन यह बड़ा विलोपन उत्पन्न करता है .

नेमाटोड के लिए, देर से चौथे चरण लार्वा या युवा वयस्क सबसे प्रभावी विकास mutagenesis के बाहर ले क्योंकि वे रोगाणु लाइन नाभिक की अधिकतम संख्या है मंच है. इसलिए यह एक तुल्यकालन कई चौथे चरण लार्वा के साथ अभिभावकों की आबादी के साथ प्रयोग शुरू करने के लिए उपयोगी है. अंडे के बजाय वयस्क कीड़े के साथ नए संस्कृतियों बनाकर सिंक्रनाइज़ संस्कृतियों बनाने का एक आसान तरीका है. निम्नलिखित पीढ़ी में ज्यादातर कीड़े एक ही उम्र के बारे में किया जाएगा. पीछे हटने का म्यूटेशनों F1 व्यक्तियों, जो बीस पांच प्रतिशत homozygous के बारे में उत्पादन होगा की संतान निरीक्षण करके पता लगाया जा सकता है.

नेमाटोड में आनुवंशिक स्क्रीन की शक्ति आगे 9 स्क्रीन के डिजाइन को संशोधित द्वारा शोषण किया जा सकता है . उभयलिंगी जीवन शैली और तेजी पीढ़ी समय के संयोजन में आनुवंशिकी के अध्ययन के लिए आदर्श नेमाटोड बनाता है.

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Disclosures: इल्ली लैब के लिए एक परिचय: संवर्धन कीड़े से mutagenesis

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: इल्ली लैब के लिए एक परिचय: संवर्धन कीड़े से mutagenesis

इस काम को NSF अनुदान 0615996 # आइओबी द्वारा वित्त पोषित किया गया.

References: इल्ली लैब के लिए एक परिचय: संवर्धन कीड़े से mutagenesis

  1. Brenner, S. Genetics 77 (1), 71 (1974).
  2. Anderson, P. Methods Cell Biol 48, 31 (1995).
  3. Yandell, M. D., Edgar, L. G., and Wood, W. B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91 (4), 1381 (1994).
  4. Pires-daSilva, A. WormBook, 1 (2005).
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  9. Jorgensen, E. M., and Mango, S. E. Nat Rev Genet 3 (5), 356 (2002).

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2 Comments

I liked the explanation and the beauty of the description. It would be quite helpful for the beginners like us to learn and execute worm handling techniques.

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Reply

Posted by: Sonu KumarJune 29, 2011, 6:03 AM

If you would like to see JoVE at your institution, please let your librarian know about us.

1.1

Reply

Posted by: Ward ParryJune 29, 2011, 9:49 AM

Thank you for your feedback, Sonu. We're glad that the article was of practical use to you.

2

Reply

Posted by: Ward ParryJune 29, 2011, 9:45 AM

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