末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

パート1：スライスと培養のための準備。

1. 培地（DMEM、25％1X HBSS、25％ウシ胎児血清、0.5％グルコース、1mMのグルタミン、2.5mMのHEPES、pH7.3）に、3 cmのMillicell - CM 0.4 -μmの文化をスライスして10cmの組織培養プレートを準備します。膜インサートと37℃のインキュベーター内で維持℃、5％CO _2。
2. それは約37にとどまるように電子レンジでPBS中4％低融点アガロースを加熱し、加熱板上でそれを維持℃に
3. PBS（140mMのNaCl、2.7 mMのKCl、10mMののNa ₂ HPO _4、1.8mmのKH ₂ PO _4）と氷上の場所で10cmの細菌シャーレを埋める。
4. ミクロトームの冷却装置を設定するか、そのバッファのトレイと冷却要素がそれより前のクールに冷凍庫に保存されていることを確認してください。

パート2：胚の埋め込み。

1. 子宮から胚を摘出し、GFPの発現を確認するために倒立蛍光顕微鏡でそれらを調べる。
2. 過度のPBSを除去するワットマン濾紙片を使用して反転10センチのシャーレと向き、それらの上に置いて胚。
3. この位置でそれを修正するために胚のアガロースを適用します。アガロースが固化してみましょう。
4. かみそりの刃で切断して胚を囲む領域を制限する。
5. その反対側に埋め込まれた胚を回転させる。
6. 胚が完全に埋め込まれていることを保証するために胚組織に追加のアガロースを適用します。
7. クリーンなエッジを持つアガロースブ​​ロックを準備し、ロックタイト406"クレイジー接着剤"に似た特殊な接着剤を使用してビブラトームチャック上にマウント。

パート3：手順をスライス。

1. あらかじめ冷却したバッファートレイと冷却要素を設定します。
2. 接着組織でチャックを挿入し、カバーまで、1X HBSSを（ ^{のCa 2 +}とMg ^{2 +}フリーHBSS、10mMのHEPES緩衝液、pH7.3、500 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン）を追加。
3. precleaned（70％エタノール）ミクロトームの刃を挿入し、固定する。
4. 450μmのスライスと氷上に置き、組織培養プレートに短縮ガラスパスツールピペットを用いてそれらを転送する - 350を準備します。
5. ピンセットを使用して、慎重に各スライスからアガロースを削除し、Millicellの文化膜に移す。約4スライスは、培養液6 mLで満たされた10cmの組織培養プレートの1つの膜上で培養することができる。
6. 37スライスをインキュベート℃、5％CO _2（培養培地：DMEM、25％1X HBSS、25％ウシ胎児血清、0.5％グルコース、1mMのグルタミン、2.5mMのHEPES、pHは7.3）。いずれかのタイムラプスイメージング系列1を実行する場合媒質定数の体積を保持する必要があります。短い時間枠のための時限イメージングシリーズのケースでは、そのままメディアを残すのに十分です。より長い培養期間のために12〜20時間後の変更は推奨されています。

パート4：顕微鏡でイメージング脊髄神経突起伸長。

1. 直立蛍光顕微鏡下でのスライス、とMillicell培養膜を含む、10cmの組織培養プレートを配置し、画像脊髄神経。
2. 次の撮影時間の時点の間に正しく配置するために顕微鏡のステージ上Millicellの文化膜の方向にラベルを付けます。
3. 4 × 10倍（開口数[NA] 0.1）、（NA 0.3）、または20倍（NA 0.5）の目標を使用してイメージ脊髄神経突起伸長。

図1は、4倍、10倍の目標と文化の20時間の間に脊髄神経の伸長を描いたイメージングシリーズを示しています。

ホモ接合tauGPFの胚の横スライスで脊髄神経の突起伸長の図1イメージングシリーズ。腹側脊髄の* =運動ニューロン、矢印= DRG。スライスの背側（D） - 腹側（V）軸が示されています。スケールバー：200μmの。

妊娠中期のマウス胚の胚切片培養（E10 - E12）を調製する方法の広範な比較では、我々はビブラトームは質問なしでの文化の全体的な実行​​可能性との再現性の両方に関して最も信頼性の高い結果を生じることを観察した神経突起伸長のパターン。対照的に、マッキルウェーン組織チョッパ^3を用いて調製したスライスは、完全に生存不能であることが判明した。私たちは、もともと胚の全体ゴミは同時に400μmのセクション^1を生成するために格子切りの周りに直列に包まれたタングステン線でスライスして準備するおそれのあるギロチンの方法^4を採用。このテクニックは、準備の速度の利点があったが、それは胚あたり最大で1つの実行可能なセクションが得られたと伸長のパラメータの変動の大きい量を示した。これらの理由から、我々はビブラトームベースの方法が準備に長い時間にもかかわらず、優れた選択であると感じている。必要性によって、このソリューションは、ビブラトームが必要ですが、結果は他の"ローテク"のアプローチによって達成されたものに比べて非常に優れているため、投資を正当化している。