פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

חלק 1: הכנת לחתוך culturing.

1. הכן 10 ס"מ תרבות צלחות רקמה עם חיתוך בינוני (DMEM, 25% HBSS 1x, 25% בסרום שור עוברית, גלוקוז 0.5%, גלוטמין 1 מ"מ, 2.5 HEPES מ"מ, pH 7.3) ו - 3 ס"מ Millicell-CM-0.4 מיקרומטר תרבות מוסיף קרום ושומרים החממה ב 37 ° C ו 5% CO _2.
2. מחממים 4% נמוך נקודת התכה agarose ב PBS במיקרוגל ולשמור אותו על צלחת חימום כך שהוא נשאר על כ 37 ° C.
3. מלאו 10 ס"מ צלחות פטרי עם בקטריולוגית PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1.8mM KH ₂ PO ₄₎ ומניחים על קרח.
4. הגדרת התקן קירור microtome או להבטיח מגש חיץ וקירור אלמנטים מאוחסנים במקפיא מראש לקרר אותו.

חלק 2: הטבעה העובר.

1. לנתח עוברים מן הרחם ולבחון אותם עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה כדי לבדוק ביטוי של GFP.
2. עוברים מקום על הפוך 10 ס"מ צלחת פטרי ו להתמצא אותם באמצעות רצועות נייר Whatman להסיר PBS מוגזמת.
3. החל agarose על העובר כדי לתקן את זה במצב הזה. בואו agarose לחזק.
4. הגבל את האזור המקיף את העובר על ידי חיתוך בסכין גילוח.
5. סובב את העובר מוטבעים על הצד השני שלה.
6. החל agarose נוסף על הרקמה העוברית כדי להבטיח את העובר מוטבע לחלוטין.
7. הכן לחסום agarose עם קצוות נקי להתקינה על vibratome צ'אק באמצעות Loctite 406, דבק מיוחד דומה "דבק בדבק מגע".

חלק 3: בחותכו ההליך.

1. הגדרת מגש חיץ precooled ואת אלמנט הקירור.
2. הכנס את צ'אק עם הרקמה דבוק ולהוסיף 1x HBSS (Ca ^{2 +-Mg 2 +} ללא HBSS, 10 mM HEPES חיץ pH 7.3, 500 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין) מכוסה עד.
3. הכנס ולתקן להב precleaned (70% אתנול) microtome.
4. הכן 350-450 מיקרומטר פרוסות ולהעביר אותם באמצעות קיצור זכוכית pipettes פסטר לתוך צלחות תרבית הרקמה כל הזמן על הקרח.
5. בעזרת זוג מלקחיים, להסיר בזהירות agarose מתוך כל פרוסה ולהעביר Millicell ממברנות תרבות. כ 4 פרוסות יכול להיות מתורבת על קרום אחד צלחת 10 ס"מ רקמה תרבות מלא מ"ל 6 של המדיום לתרבות.
6. דגירה פרוסות בשעה 37 ° C ו 5% CO ₂ (בינוני תרבות: DMEM, 25% HBSS 1x, 25% בסרום שור עוברית, גלוקוז 0.5%, 1mm גלוטמין, HEPES 2.5 מ"מ, pH 7.3). אם אחד מבצע זמן לשגות סדרה הדמיה אחד צריך לשמור על נפח קבוע בינוני. במקרה של סדרה הדמיה מתוזמנים עבור פרק זמן קצר זה מספיק כדי להשאיר את המדיום כפי שהוא. במשך תקופות ארוכות יותר שינויים בתרבות לאחר 12-20 שעות מומלץ.

חלק 4: תוצאה הדמיה עצב עמוד השדרה על המיקרוסקופ.

1. תמונה העצבים של עמוד השדרה הצבת 10 ס"מ תרבות צלחת רקמות, המכיל ממברנות Millicell תרבות עם פרוסות, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף.
2. תווית הכיוון של ממברנות Millicell התרבות על הבמה מיקרוסקופ לעמדה נכונה במהלך הנקודה הדמיה בפעם הבאה.
3. עצב השדרה תמונה תולדה באמצעות 4x (מספרי הצמצם [NA] 0.1), 10x (NA 0.3), או 20x (NA 0.5) מטרות.

איור 1 מציג סדרת הדמיה המתארת ​​את תולדה עצב עמוד השדרה במהלך 20 שעות של תרבות עם מטרות 10x ו 4x.

איור 1 Imaging סדרת תולדה עצב השדרה פרוסת רוחבי של העובר tauGPF הומוזיגוטים. * = הנוירונים המנוע של חוט השדרה הגחון, חץ = DRG. הגבי (D)-הגחוני (V) ציר של הפרוסה מצוין. Scalebars: 200 מיקרומטר.

לשם השוואה מקיפה של שיטות להכין תרבויות פרוסה עובריים של אמצע ההיריון עוברי עכברים (E10 - E12), ראינו כי vibratome מייצר ללא ספק את התוצאות הכי אמין לגבי הכדאיות הן הכוללת של תרבויות ושל שחזור של תוצאה העצב דפוסי. לעומת זאת, פרוסות מוכן באמצעות מסוק רקמות McIlwain ³ התבררה inviable לחלוטין. העסקנו במקור שיטה הגיליוטינה ^4, שבו כל המלטה של עוברים יכולה להיות מוכנים בו זמנית על ידי חיתוך עם חוטי טונגסטן עטוף סדרתי סביב חיתוך באח לייצר 400 מיקרומטר בסעיפים ^1. למרות הטכניקה הזו היה יתרון של מהירות הכנה, זה הניב לכל היותר קטע אחד קיימא לכל העובר והראה כמות גדולה של השתנות בפרמטרים תוצאה. מסיבות אלה, אנו חשים כי שיטת vibratome מבוססי היא בחירה מעולה למרות הזמן כבר בהכנה. אמנם זה פתרון בהכרח דורש vibratome, התוצאות עדיפים בהרבה על מה שהושג באמצעות אחרים "low-tech" גישות, ובכך מצדיק את ההשקעה.