Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

Parte 1: Preparación para el corte y el cultivo.

1. Prepare 10 cm placas de cultivo con corte medio (DMEM, 25% 1x HBSS, el 25% de suero fetal bovino, 0,5% de glucosa, 1 mM de glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) y de 3 cm Millicell-CM-cultura 0.4 micras inserta la membrana y mantener en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
2. Calentar el 4% de bajo punto de fusión de agarosa en PBS en el microondas y mantenerlo en la placa de calefacción para que quede aproximadamente a 37 ° C.
3. Llenar 10 cm bacteriológicas placas de Petri con PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mm de KH ₂ PO ₄₎ y el lugar en el hielo.
4. Configure el dispositivo de refrigeración microtomo o asegurarse de que la bandeja de amortiguación y de refrigeración los elementos se almacenan en el congelador para pre-enfriar.

Parte 2: La inclusión de embriones.

1. Diseccionar embriones del útero y las examinan con un microscopio invertido fluorescentes para detectar la expresión de GFP.
2. Embriones en lugar de un plato invertido 10 cm Petri y orientarlos con tiras de papel Whatman para eliminar exceso de PBS.
3. Aplicar agarosa en el embrión para fijarlo en esa posición. Vamos agarosa solidifique.
4. Límite de la zona que rodea el embrión mediante el corte con una cuchilla de afeitar.
5. Gire el embrión embebido hacia el otro lado.
6. Aplicar más de agarosa en el tejido embrionario para asegurarse de que el embrión está plenamente integrado.
7. Prepare bloque de agarosa con bordes limpios y de montaje en vibratome plato con Loctite 406, un pegamento especial similar a la "Krazy Glue".

Parte 3: Cortar procedimiento.

1. Configure la bandeja de buffer pre-enfriado y el disipador de calor.
2. Inserte el mandril con el tejido pegado y añade 1x HBSS (Ca ^{2 +-Mg 2 +} libre de HBSS, 10 mM HEPES pH 7,3, 500 U / ml de penicilina / estreptomicina) hasta que esté cubierto.
3. Insertar y fijar un precleaned (70% etanol) hoja de microtomo.
4. Preparar 350 a 450 micras rodajas y transferirlos con pipetas Pasteur de vidrio acortado en placas de cultivo de tejidos se mantienen en hielo.
5. Con un par de pinzas, retire con cuidado de cada rebanada de agarosa y transferencia a membranas Millicell cultura. Aproximadamente 4 rebanadas pueden ser cultivadas en una membrana de tejido en una placa de 10 cm de cultura llena de 6 mL de medio de cultivo.
6. Incubar cortes a 37 ° C y 5% de CO ₂ (medio de cultivo: DMEM, 25% 1x HBSS, el 25% de suero fetal bovino, 0,5% de glucosa, 1 mM glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7,3). Si uno realiza un lapso de tiempo la serie de imágenes se debe mantener el volumen de medio de constantes. En el caso de series de tiempo de imágenes para un corto período de tiempo es suficiente para dejar el medio como es. Para períodos más largos cultura cambia después de 12-20 horas se recomienda.

Parte 4: fruto de imágenes del nervio espinal en el microscopio.

1. Imagen de los nervios raquídeos a la colocación de una placa de tejido de 10 cm de la cultura, que contiene las membranas Millicell la cultura con las rebanadas, con un microscopio fluorescente en posición vertical.
2. Etiqueta de la orientación de las membranas de la cultura Millicell en platina del microscopio para posicionar correctamente en el punto de imagen la próxima vez.
3. Consecuencia la imagen del nervio espinal utilizando 4x (apertura numérica [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) o 20x (NA 0.5) objetivos.

La figura 1 muestra una serie de imágenes que representan el fruto del nervio espinal durante 20 horas de cultura con los objetivos de 4x y 10x.

Figura 1 Imagen serie de consecuencia del nervio espinal en un corte transversal de un embrión tauGPF homocigotos. * = Neuronas motoras de la médula espinal ventral, flecha = DRG. El dorsal (D)-ventral (V), el eje de la rebanada se indica. Scalebars: 200 micras.

En una amplia comparación de los métodos para preparar cultivos de embriones rebanada de embriones de ratón mitad de la gestación (E10 - E12), hemos observado que un vibratomo produce sin lugar a dudas los resultados más confiables con respecto tanto a la viabilidad general de las culturas y la reproducibilidad de los los patrones de derivación del nervio. Por el contrario, las rebanadas de preparados con un helicóptero del tejido McIlwain ³ resultó ser completamente inviable. Lo que originalmente se empleó un método guillotina ^4, en el que podría ser una camada entera de los embriones al mismo tiempo preparado por cortar con cables de tungsteno envuelto en serie en torno a una rejilla para producir el corte de 400 micras secciones ^1. Aunque esta técnica tiene la ventaja de acelerar su preparación, que produjo más de un sector viable y por embrión y mostró una gran cantidad de variabilidad en los parámetros de extensión. Por estas razones, creemos que un método basado en vibratome es la mejor opción a pesar del tiempo ya en preparación. Aunque esta solución por necesidad requiere un vibratome, los resultados son muy superiores a lo que se ha logrado a través de otras de "baja tecnología" se acerca, y por lo tanto justifica la inversión.