Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

Parte 1: Preparando-se para cortar e cultura.

1. Prepare 10 cm de placas de cultura de tecido com corte médio (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% de soro fetal bovino, a glicose 0,5%, 1 mM de glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7.3) e 3 cm de Millicell-CM cultura 0,4 mícrons insere membrana e manter em estufa a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Aqueça 4% baixo ponto de fusão de agarose em PBS no microondas e mantê-lo na placa de aquecimento para que fique em aproximadamente 37 ° C.
3. Preencher 10 cm de pratos bacteriológica Petri com PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mm KH ₂ PO ₄₎ e colocar no gelo.
4. Configurar dispositivo de resfriamento micrótomo ou garantir que bandeja de tampão e de refrigeração elementos são armazenados no freezer para pré-cool-lo.

Parte 2: incorporação de embriões.

1. Dissecar os embriões do útero e examiná-las com um microscópio invertido fluorescente para verificar se há expressão GFP.
2. Embriões lugar em uma invertida de 10 cm Placa de Petri e orientá-los usando tiras de papel Whatman para remover PBS excessiva.
3. Aplicar agarose sobre o embrião para corrigi-lo nesta posição. Deixe agarose solidificar.
4. Limitar a área que circunda o embrião, cortando com uma lâmina de barbear.
5. Gire o embrião incorporado em seu outro lado.
6. Aplicar agarose adicionais sobre tecido embrionário para garantir que o embrião está completamente incorporado.
7. Prepare bloco agarose com bordas limpas e montagem em vibratome chuck usando Loctite 406, uma cola especial semelhante ao "Krazy Glue".

Parte 3: Slicing procedimento.

1. Configure a bandeja de tampão pré-resfriada eo elemento de refrigeração.
2. Insira o chuck com o tecido colado e adicione HBSS 1x (Ca ^{2 +-Mg 2 +} livre HBSS, 10 mM HEPES pH 7,3, 500 U / ml de penicilina / estreptomicina) até coberta.
3. Inserir e fixar uma lâmina de micrótomo precleaned (70% etanol).
4. Prepare 350-450 fatias mm e transferi-los usando encurtado pipetas de vidro pasteur em placas de cultura de tecidos conservados no gelo.
5. Usando uma pinça, retire cuidadosamente cada fatia de agarose e transferência para membranas Millicell cultura. Cerca de 4 fatias podem ser cultivadas em uma membrana em uma placa de cultura de 10 cm de tecido preenchido com 6 mL de meio de cultura.
6. Incubar fatias a 37 ° C e 5% CO ₂ (médio Cultura: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% soro fetal bovino, a glicose 0,5%, 1 mM de glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7.3). Se um time-lapse realiza série de imagens deve-se manter constante o volume de meio. No caso da série programada de imagem para um curto espaço de tempo é suficiente para deixar o meio como ela é. Para períodos de mudanças mais cultura após 12-20 horas são recomendados.

Parte 4: Imaging conseqüência do nervo espinhal ao microscópio.

1. Nervos espinhais colocar uma imagem de 10 cm placa de cultura de tecidos, contendo membranas cultura Millicell com fatias, sob um microscópio fluorescente na posição vertical.
2. Rótulo a orientação das membranas cultura Millicell no palco microscópio para posicionar corretamente durante o próximo ponto de imagem tempo.
3. Imagem conseqüência do nervo espinhal utilizando 4x (abertura numérica [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) ou 20x (NA 0.5) objetivos.

A Figura 1 mostra uma série de imagens retratando o crescimento do nervo espinhal, durante 20 horas de cultura com objectivos de 4x e 10x.

Figura série de imagens de uma conseqüência do nervo espinhal em uma fatia transversal de um embrião tauGPF homozigótica. * = Neurônios motores da medula espinhal ventral, seta = DRG. O dorsal (D)-ventral eixo (V) da fatia é indicado. Scalebars: 200 mM.

Em uma extensa comparação de métodos para preparar culturas fatia embrionárias de embriões meados de gestação mouse (E10 - E12), temos observado que um vibratome produz, sem dúvida, os resultados mais confiáveis ​​no que diz respeito a ambos os viabilidade global das culturas e da reprodutibilidade a conseqüência padrões nervosas. Em contraste, as fatias preparadas usando um helicóptero tecido McIlwain ³ mostrou-se completamente inviável. Nós originalmente empregado um método guilhotina ^4, em que uma ninhada inteira de embriões poderiam ser simultaneamente preparado por corte com fios de tungstênio envolto em série em torno de um corte de grelha para produzir 400 mícrons seções ^1. Embora essa técnica tinha a vantagem da velocidade de preparação, que rendeu, no máximo, uma seção de embriões viáveis ​​por e mostrou uma grande quantidade de variabilidade dos parâmetros conseqüência. Por estas razões, nós sentimos que um método baseado em vibratome é a melhor opção, apesar do maior tempo de preparação. Embora esta solução por necessidade requer um vibratome, os resultados são muito superiores ao que tem sido alcançado através de outras "low-tech" se aproxima e, assim, justifica o investimento.