Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

Bölüm 1: dilimleme ve kültür için hazırlanması.

1. , Orta (DMEM 1x HBSS,% 25 fetal sığır serumu,% 0.5 glikoz, 1 mM glutamin, 2,5 mM Hepes, pH 7.3,% 25) ve 3 cm Millicell-CM 0.4 mikron kültür dilimleme 10 cm doku kültürü tabak hazırlayın membran ekler ve 37 ° inkübatör tutmak ° C ve% 5 CO _2.
2. Yaklaşık 37 kalır böylece mikrodalga PBS içinde% 4 düşük erime noktası agaroz Isı ve ısıtma plakası tutmak ° C
3. PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1.8mm KH ₂ PO ₄₎ ve buz üzerinde yer 10 cm bakteriyolojik Petri kapları doldurun.
4. Mikrotom soğutma cihazı kurun veya tampon tepsisi ve soğutma elemanları öncesi cool dondurucuda saklanan sağlamak.

Bölüm 2: Embriyo gömme.

1. Embriyolar rahim inceleyin ve GFP ifade kontrol etmek için ters bir floresan mikroskop ile incelenmesi.
2. 10 cm ters bir Petri kabı ve yönlendirmek onları yerleştirin embriyolar whatman kağıt şeritleri kullanarak aşırı PBS kaldırmak için.
3. Bu pozisyonda onu düzeltmek için embriyo üzerinde agaroz uygulayın. Agaroz katılaşmaya.
4. Bir jiletle keserek embriyo çevreleyen alanı sınırlayın.
5. Diğer yüzüne gömülü embriyo döndürün.
6. Embriyo tamamen gömülü olduğundan emin olmak için ek agaroz embriyonik doku uygulayın.
7. Loctite 406, "Krazy Glue" 'e benzer özel bir tutkal kullanarak vibratome Chuck temiz kenarlar ve montaj agaroz blok hazırlayın.

Bölüm 3: prosedürü Dilimleme.

1. Precooled tampon tepsisi ve soğutma elemanı ayarlayın.
2. Yapıştırılmış dokusu ile mandreni takın ve 1x HBSS (Ca ^{2 +-Mg 2 +} ücretsiz HBSS, 10 mM HEPES tamponu pH 7.3, 500 U / ml penisilin / streptomisin) kadar kapalı.
3. Yerleştirin ve bir precleaned (70% Etanol) mikrotom bıçak düzeltmek.
4. 350 - 450 mikron dilimleri hazırlayın ve onları kısaltılmış cam pasteur pipetler doku kültürü plakaları ile transfer buz üzerinde tutulmalıdır.
5. Bir çift forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde her bir dilim ve kültür membranlar Millicell transfer agaroz kaldırmak. Yaklaşık 4 dilim 6 ml kültür ortamı ile dolu bir 10 cm doku kültürü plakası bir membran üzerinde yetiştirilebilir.
6. 37 ° dilimleri ° C'de ve% 5 CO ₂ (orta Kültür: DMEM,% 25 1x HBSS,% 25 fetal sığır serumu,% 0.5 'lik glukoz, 1mm glutamin, 2.5 mM HEPES, pH 7.3). Bir zaman atlamalı görüntüleme serisi gerçekleştirir ise bir orta hacmi sabit tutmak gerekir. Zamanlı görüntüleme serisinin kısa bir zaman diliminde durumda olduğu gibi, orta bırakmak için yeterli. Uzun kültür dönemleri değişiklikler için 12-20 saat sonra tavsiye edilir.

Bölüm 4: mikroskop Görüntüleme spinal sinir sonucudur.

1. Spinal sinirler dik bir floresan mikroskop altında dilimleri, Millicell kültür membranlar içeren, 10 cm doku kültürü plakası yerleştirerek.
2. Sonraki görüntüleme süresi noktası sırasında mikroskop sahnede Millicell kültür membranlar yönünü doğru biçimde konumlandırmak için etiketleyin.
3. Resim spinal sinir akıbet 4x (sayısal diyafram [NA] 0.1), 10x (NA 0.3), veya 20x (NA 0.5) amaçlar.

Şekil 1, 4x ve 10x hedefleri ile 20 saat boyunca kültür spinal sinir akıbet resmeden bir görüntüleme serisi gösterir.

Şekil 1 Görüntüleme serisi homozigot tauGPF embriyo enine bir dilim spinal sinir akıbet. * = Motor nöronlar ventral omurilik, ok = DRG. Dilim (D) dorsal-ventral (V) eksen gösterilir. Scalebars: 200 mm.

Gebeliğin orta fare embriyoları embriyonik dilim kültürleri (E10 - E12) hazırlamak için kapsamlı bir yöntem karşılaştırıldığında, biz bir vibratome soru kültürlerin genel uygulanabilirliği ve tekrarlanabilirliği hem açısından en güvenilir sonuçlar verdiğini gözlemledik sinir akıbet desenler. Buna karşılık, dilimler ³ tamamen inviable olduğunu kanıtladı McIlwain doku kıyıcı kullanılarak hazırlanmıştır. Biz aslında tüm embriyoların bir çöp eş zamanlı seri üretmek için 400 mikron bölüm ¹ rendeleyin bir kesim çevresinde sarılmış tungsten teller ile dilimleme tarafından hazırlanan olabilir ^4, bir giyotin yöntemi kullandı. Bu teknik hazırlık hız avantajı olmasına rağmen, embriyo başına en az bir canlı bölümünde vermiştir ve büyük miktarda akıbet parametrelerde değişkenlik gösterdi. Bu nedenlerden dolayı, biz vibratome tabanlı bir yöntem hazırlık uzun süre olmasına rağmen üstün bir seçim olduğunu düşünüyoruz. Zorunlu olarak bu çözümün vibratome gerektirmesine rağmen, sonuçlar çok üstün diğer "düşük teknolojili" yaklaşımları yoluyla elde edilmiştir ve bu nedenle yatırım haklı.