Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo's voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Deel 1: Voorbereiding voor het snijden en het kweken.

1. Bereid 10-cm weefselkweek platen met het snijden van medium (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% foetaal runderserum, 0,5% glucose, 1 mM glutamine, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) en 3-cm Millicell-CM 0.4-um cultuur membraan inserts en in de broedstoof bij 37 ° C te houden en 5% CO _2.
2. Verwarm 4% een laag smeltpunt agarose in PBS in de magnetron en houdt het bij verhitting plaat, zodat het blijft op ongeveer 37 ° C.
3. Vul 10-cm bacteriologische Petrischalen met PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mm KH ₂ PO ₄₎ en leg ze op ijs.
4. Stel microtoom koeling of ervoor te zorgen dat de buffer lade en koelelementen worden opgeslagen in de vriezer om pre-cool is.

Deel 2: Embryo inbedding.

1. Ontleden embryo uit de baarmoeder en bekijk je ze met een omgekeerde fluorescentie microscoop om te controleren of GFP expressie.
2. Plaats embryo's op een omgekeerde 10-cm petrischaal en oriënteren ze met behulp van Whatman papier strips te veel PBS te verwijderen.
3. Van toepassing zijn op de embryo agarose op te lossen in deze positie. Laat agarose stollen.
4. Beperk de omgeving van het embryo door te snijden met een scheermesje.
5. Draai de embedded embryo op zijn andere kant.
6. Toe te passen extra agarose op embryonaal weefsel om ervoor te zorgen dat het embryo volledig is ingebed.
7. Bereid agarose blok met schone randen en monteren op vibratome chuck met Loctite 406, een speciale lijm gelijkaardig aan "Krazy Glue".

Deel 3: Fineersnijmachine procedure.

1. Stel de voorgekoeld buffer lade en het koelelement.
2. Plaats de boorkop met de gelijmde weefsel en voeg 1x HBSS (Ca ^{2 +-Mg 2 +-vrij} HBSS, 10 mM HEPES buffer pH 7,3, 500 U / ml penicilline / streptomycine) tot gedekt.
3. Invoegen en vast een voorgereinigde (70% ethanol) microtoom mes.
4. Bereid 350 tot 450 micrometer plakjes en breng ze met behulp van verkorte glas pasteurpipetten in weefselkweek platen bewaard op ijs.
5. Met behulp van een tang, verwijder voorzichtig agarose uit elke plak en overdracht van cultuur membranen Millicell. Ongeveer 4 plakjes kunnen worden gekweekt op een membraan in een 10-cm weefselkweek plaat gevuld met 6 ml kweekmedium.
6. Incubeer plakken bij 37 ° C en 5% CO ₂ (Cultuur medium: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% foetaal runderserum, 0,5% glucose, 1 mM glutamine, 2,5 mM HEPES, pH 7,3). Als men voert time-lapse imaging serie een moet houden van het volume van het medium constant. In het geval van getimede imaging-serie voor een korte tijd is het voldoende om het medium te laten zoals het is. Voor langere periodes cultuur verandert na 12-20 uur wordt aanbevolen.

Deel 4: Imaging spinale zenuw uitgroei aan de microscoop.

1. Afbeelding spinale zenuwen het plaatsen van een 10-cm weefselkweek plaat, met daarin Millicell cultuur membranen met plakjes, onder een rechte fluorescentiemicroscoop.
2. Het etiket van de oriëntatie van Millicell cultuur membranen op microscoop podium om de juiste positie in de komende beeldvorming tijdstip.
3. Afbeelding spinale zenuw uitgroei met 4x (numerieke lensopening [NA] 0,1), 10x (NA 0.3) of 20x (NA 0,5) doelstellingen.

Figuur 1 toont een imaging-serie afbeeldingen van de spinale zenuw uitgroei tijdens de 20 uur van de cultuur met 4x en 10x doelstellingen.

Figuur 1 Imaging serie van spinale zenuw uitgroei in een transversale slice van een homozygote tauGPF embryo. * = Motorische neuronen van de ventrale ruggenmerg, pijl = DRG. De dorsale (D)-buik (V) as van het schijfje wordt aangegeven. Scalebars: 200 pm.

In een uitgebreide vergelijking van methoden voor het embryonale slice culturen van mid-dracht muis embryo's (E10 - E12) voor te bereiden, hebben we vastgesteld dat een vibratome produceert zonder twijfel de meest betrouwbare resultaten met betrekking tot zowel de algemene leefbaarheid van de culturen en de reproduceerbaarheid van de zenuw uitgroei patronen. In tegenstelling, plakjes bereid met behulp van een tissue McIlwain chopper ³ bleek te zijn volledig inviable. We oorspronkelijk in dienst een guillotine methode ^4, waarin een heel nest van embryo's tegelijkertijd zou kunnen worden voorbereid door het snijden met wolfraam draden in serie rond een snij-rooster tot 400-um secties ^een te produceren. Hoewel deze techniek het voordeel van de snelheid van de voorbereiding, het leverde hooguit een levensvatbare embryo per sectie en toonden een grote hoeveelheid variabiliteit in uitgroei parameters. Om deze redenen, voelen we dat een vibratome-gebaseerde methode is de superieure keuze, ondanks de langere tijd in voorbereiding. Hoewel deze oplossing door de noodzakelijkheid vereist een vibratome, de resultaten zijn veel beter wat er is bereikt door andere "low-tech"-benaderingen, en dus rechtvaardigt de investering.