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अभिव्यक्ति और HEK-293T कक्ष में पुनः संयोजक वोल्टेज gated आयन चैनल के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अभिकर्मक रणनीति

, ,

Department of Biology, University of Waterloo

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Cite this Article: अभिव्यक्ति और HEK-293T कक्ष में पुनः संयोजक वोल्टेज gated आयन चैनल के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अभिकर्मक रणनीति

Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J. Vis. Exp. (47), e2314, doi:10.3791/2314 (2011).

Protocol: अभिव्यक्ति और HEK-293T कक्ष में पुनः संयोजक वोल्टेज gated आयन चैनल के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अभिकर्मक रणनीति

1. सेल संस्कृति

  1. है Dulbecco संशोधित ईगल्स मध्यम (DMEM, सिग्मा Aldrich) के 6mL युक्त मानव भ्रूण गुर्दे 293T कोशिकाओं (HEK-293T, Invitrogen) निकाल 25cm 2 (; Cellstar GREINER जैव - एक ऊतक इलाज संस्कृति) बोतल में पक्षपाती monolayers में बड़े हो रहे हैं 10 के साथ पूरक v / v% भ्रूण गोजातीय (FBS, सिग्मा Aldrich) सीरम, 1% सोडियम पाइरूवेट, और 37 पर μg / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन / 250 डिग्री सेल्सियस के साथ 5% सीओ 2) .

    कक्ष सीओ 2 इन्क्यूबेटरों में incubated रहे हैं (5% सीओ 2) या तो डिग्री सेल्सियस या 28 डिग्री सेल्सियस 37 सेट एक लामिना का प्रवाह हुड में सभी कोशिकाओं के साथ काम किया है.

  2. कक्ष आम तौर पर द्वि - साप्ताहिक विभाजित कर रहे हैं, ~ 90% confluency से सोमवार को एक कमजोर पड़ने 1:08 में है, और गुरुवार पर 1:12. (HEK-293T कोशिकाओं मढ़वाया की छवियों के लिए अलग अलग घनत्व में चित्रा 1 देखें)
  3. बंटवारे के लिए, मीडिया आकांक्षा द्वारा कोशिकाओं की बोतल से निकाल दिया जाता है, और कोशिकाओं trypsin (सिग्मा Aldrich) 37 डिग्री सेल्सियस को उल्टे फ्लास्क गर्म समाधान के 1ml को लागू करने के द्वारा अलग कर रहे हैं. फ्लास्क बाद और उल्टे हाथ से धीरे हिल जैसे कि trypsin समाधान कई बार संलग्न कक्षों पर चलता है. trypsin तो जल्दी आकांक्षा और कुप्पी है जो एक बार फिर कोशिकाओं पर trypsin समाधान कदम हिल है में micropipetted trypsin के 250 μL द्वारा हटा दिया जाता है.
  4. बोतल तो सीओ 2 इनक्यूबेटर में incubated हैं ° 3-5 मिनट के लिए सी 37 के लिए सेट है, और एक विंदुक गर्म पूरक DMEM 4mL में कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अधूरा trypsinization और निलंबन कोशिकाओं के clumps के कारण और कोशिकाओं को ऊपर नहीं है और इरादा monolayer में विकसित करने के लिए कारण सकता है. से अधिक trypsinization कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है.
  5. 01:08 विभाजन के लिए, एक नया DMEM के 5.5mL युक्त कुप्पी के लिए जोड़ा निलंबित कोशिकाओं के 500μL जोड़ने, एक 1:12 विभाजन के लिए (चित्रा 1 देखें), 333μL कक्षों की एक नई DMEM के 5.7mL युक्त कुप्पी के लिए जोड़ रहे हैं . बोतल धीरे तब मिश्रित कर रहे हैं एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर को हस्तांतरित. 37 पर 3-4 ऊष्मायन के दौरान डिग्री सेल्सियस बंटवारे के बाद, कोशिकाओं तलछट और कुप्पी का पालन. कोशिकाओं शुरू दौर देखो, लेकिन समतल और मजबूत लगाव (चित्रा 1) के साथ एक्सटेंशन (pseudopodia) होगा.

    कक्ष एक उम्मीद के मुताबिक तरीके से एक अनुयायी monolayer में हो जाना चाहिए. सेल विकास और उपस्थिति atypical या असंगत है, गरीब तकनीक या संदूषण (बैक्टीरिया mycoplasma /) विचार किया जाना चाहिए. सफल टिशू कल्चर के लिए कुंजी निरंतरता है.

2. HEK-293T की पुनः संयोजक आयन चैनल cDNAs साथ अभिकर्मक

  1. यहाँ विभिन्न आयन चैनल से cDNAs में क्लोन हैं pIRES2 EGFP (बी.डी. बायोसाइंसेज Clontech) प्लाज्मिड, जो बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रतिदीप्ति (EGFP) के माध्यम से सकारात्मक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है. EGFP क्लोन सीडीएनए अनुवाद के माध्यम से एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट पर डालने के सिर्फ सीडीएनए और EGFP कोडन अनुक्रम (चित्रा 2) के अपस्ट्रीम डालने के बहाव शुरू के रूप में एक ही प्रतिलेख से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में उत्पादित है. फ्लोरोसेंट HEK-293T की छवियों, सकारात्मक pIRES2 EGFP constructs में कैल्शियम चैनल सब यूनिटों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट चित्रा 3 देखें.
  2. अभिकर्मक करने के लिए, पहले एक नया फ्लास्क में एक पूरी तरह से मिला हुआ फ्लास्क 01:04 विभाजित है, और कोशिकाओं के लिए 37 में संलग्न करने के लिए अनुमति दी जाती है ° सी सीओ 2 इनक्यूबेटर में 3-4 घंटे के लिए ( चित्रा 1 देखें).
  3. बाद कोशिकाओं जुड़े होते हैं, एक मानक कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक रणनीति (कोल्ड स्प्रिंग हार्बर प्रोटोकॉल) आयन चैनल और HEK कोशिकाओं में गौण सबयूनिट cDNAs युक्त constructs परिचय करने के लिए प्रयोग किया जाता है. आमतौर पर, अभिकर्मक समाधान बनना के 600 μL में डीएनए के 12μg की कुल फ्लास्क / अभिकर्मक के प्रति इस्तेमाल किया.
  4. अभिकर्मक समाधान के बाद ड्रॉप - वार कोशिकाओं पर pipetted है, फ्लास्क एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात पर रखा है.
  5. निम्नलिखित अभिकर्मक, कोशिकाओं ध्यान से गर्म मीडिया या फॉस्फेट के साथ तीन बार धोया खारा pipetting धोने समाधान एक औंधा फ्लास्क में, तो धीरे धीरे कुप्पी ईमानदार मोड़ और कमाल फ्लास्क द्वारा (4-5 एमएल) buffered ताकि अधिक धोने समाधान चालें कोशिकाओं. यदि यह ध्यान नहीं किया जाता है कोशिकाओं detatch और धोने के तीन चरणों के बाद कुछ छोड़ दिया जाएगा सकता है. धोने दो बार दोहराया जाता है, तो मीडिया के 6 एमएल फ्लास्क जोड़ रहे हैं और यह 37 ° सी 2 बजे के लिए, तो एक 28 को हस्तांतरित ° सी इनक्यूबेटर में incubated है.
  6. PIRES2-EGFP constructs के सफल अभिकर्मक 1 से 3 दिनों एक epifluorescence अभिकर्मक का उपयोग कर खुर्दबीन के बाद पुष्टि की जा सकती है. कोशिकाओं है कि हरी प्रतिदीप्ति जब पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में सकारात्मक ट्रांसफ़ेक्ट हैं और heterologous आयन चैनल और EGFP प्रोटीन व्यक्त करना चाहिए.

3. Electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी में चढ़ाना HEK293T कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट

nt "> विभिन्न आयन चैनल HEK कोशिकाओं के कोशिका झिल्ली पर अलग अलग क्षमता के साथ व्यक्त, और इस तरह के रूप में, इस प्रोटोकॉल के शेष कुछ अनुकूलन की आवश्यकता है चैनल सतह सफल electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति अभिव्यक्ति को अधिकतम HEK कोशिकाओं में heterologous आयन चैनलों की अभिव्यक्ति. गैर स्तनधारी स्रोतों से उन लोगों की, विशेष रूप से (1) बड़े प्रोटीन लंबे समय की आवश्यकता के आकार का अनुवाद और प्लाज्मा झिल्ली (2) तह और लक्ष्यीकरण में एक स्तनधारी चैनल प्रोटीन आवश्यक पर रूपांकनों के अभाव या असमानताओं को बताया स्थानीयकरण सहित कुछ चुनौतियों उपस्थित हो सकता है कोशिका लाइन (3) codon उपयोग आवृत्तियों में प्रजातियों से मतभेद इन संयुक्त कारकों के सभी प्रजातियों के लिए 28 पर लंबी ऊष्मायन समय के लिए एक आवश्यकता में परिणाम कर सकते हैं, सी, (जो बाहर पतला होता है जो कोशिका विभाजन के बिना प्रभावी प्रोटीन अभिव्यक्ति और सतह स्थानीयकरण सुनिश्चित ° heterologous cDNAs और प्रोटीन). दुर्भाग्य से, 28 में लंबी अवधि के लिए ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस सेल टुकड़ी और गरीब झिल्ली स्थिरता electrophysiological रिकॉर्डिंग मुश्किल बनाने के लिए होता है हम पारंपरिक अभिकर्मक रणनीतियों को संशोधित करने का फैसला किया (थॉमस और स्मार्ट 2005 में) की समीक्षा के क्रम में ऊष्मायन कम से कम. 28 पर ° सी पहले रिकॉर्डिंग करने के लिए और सतह अभिव्यक्ति को अधिकतम. हमारे विधि की आवश्यकता है कि कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट, 28 पर 3-7 दिनों की अवधि के लिए incubated डिग्री सेल्सियस, तो कोशिकाओं trypsinization द्वारा अलग कर रहे हैं और coverslips पर replated और 37 में incubated ° सी जो झिल्ली restabilizes और coverslips पर कक्षों की मजबूत लगाव के लिए अनुमति देता है. कोशिकाओं तो दूर सही दर्ज किया जा करने में सक्षम हैं, या समय की अतिरिक्त अवधि के लिए 28 पर incubated जा सकता डिग्री सेल्सियस हम coverslips पर यह बाद में मंच पर कक्षों की replating पाते हमारे विधि में चैनल व्यक्त की उच्च संख्या, अलग संलग्न कोशिकाओं के साथ coverslips उत्पादन के लिए बिल्कुल जरूरी हो.

, और एक हम दो वैकल्पिक रणनीति, एक कि हम आयन चैनलों और आयन चैनल परिसरों कि बड़े कोशिकी डोमेन trypsin पाचन (Senatore और Spafford २०१० जैसे Cav3 वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल) के लिए असुरक्षित हो सकता है है शामिल नहीं है के लिए उपयोग करने के लिए पसंद करते हैं, वर्तमान कि हम आयन चैनलों कि बड़े कोशिकी डोमेन शामिल नहीं है (. Senatore, एट अल 2010 जैसे एल प्रकार वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल और उनके सहायक सब यूनिटों) के लिए उपयोग करें .

    1. कक्ष 28 ° 2-6 दिनों के लिए सी कोशिका विभाजन को रोकने के लिए और अनुवाद प्रोटीन के संचय के लिए अनुमति देने के incubated हैं. यह ऊष्मायन समय प्रत्येक आयन चैनल के लिए empirically निर्धारित करना चाहिए, क्योंकि सतह अभिव्यक्ति आंतरिक कारकों है कि निर्देशित कैसे चैनलों के नवजात mRNA और polypeptide दृश्यों translational मशीनरी और स्रावी मार्ग के साथ बातचीत, क्रमशः पर निर्भर है.
    2. पहले चढ़ाना, परिपत्र कांच coverslips (सर्किलों सं 1 - 0.13 0.17mm मोटी, आकार: 12 मिमी, फिशर साइंटिफिक कनाडा, ओटावा, ओंटारियो) के अनुसार निर्माता के निर्देशों के रूप में पाली - एल lysine (सिग्मा) के साथ लेपित हैं.
    3. मीडिया आकांक्षा से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से हटा दिया है, और 37 के 1 एमएल डिग्री सेल्सियस trypsin समाधान (सिग्मा) एक औंधा फ्लास्क (सेल ऊपर की ओर) में micropipetted है. फ्लास्क फिर धीरे ईमानदार स्थिति औंधा trypsin कक्षों पर चलाने के लिए अनुमति, और कुप्पी तो फिर उलटा और trypsin आकांक्षा द्वारा हटा दिया. गर्म trypsin के 250 μL तब कक्षों पर सीधे जोड़ा और फ्लास्क 37 पर incubated है ° सी के कोशिकाओं detatch तक 3-5 मिनट के लिए.
    4. इस बीच, पाली एल lysine-लेपित coverslips 6mm संस्कृति बर्तन में रखा जाता है (3-8 पकवान प्रति) और गर्म संस्कृति मीडिया के 5 एमएल प्रत्येक पकवान में जोड़ा जाता है .
    5. Trypsinized कोशिकाओं गर्म संस्कृति मीडिया के 4mL के साथ ऊपर और नीचे pipetting ~ 6 बार resuspended हैं, तो resuspended कोशिकाओं के 250 500μL संस्कृति coverslips युक्त व्यंजन में micropipetted हैं. कक्षों के अलावा पहले, micropipette की नोक coverslips पर नीचे पुश करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे डिश के तल पर हैं करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    6. कोशिकाओं तो 37 में incubated ° 3hrs के लिए सी उन्हें coverslips का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं, और तब वे 28 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं इस बिंदु पर, कोशिकाओं electrophysiological रिकॉर्डिंग है, जो आदर्श अलग - संलग्न कोशिकाओं (Fig.3 coverslips पर चढ़ाना के पहले और बाद में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं दिखाता है) के साथ किया जाता है के लिए तैयार हैं. 37 में भी लंबे समय के लिए कोशिकाओं छोड़कर ° सी कोशिका विभाजन में परिणाम देगा.
    1. बड़े कोशिकी डोमेन के साथ / चैनल चैनल परिसरों व्यक्त कोशिकाओं की तैयारी बहुत उसी तरह जैसा कि उपर्युक्त में किया जाता है, अपवाद के साथ कि coverslips 28 ° सी electrophysiological रिकॉर्डिंग से पहले एक अतिरिक्त 2-4 दिनों के लिए बाहर किया जाता है incubated हैं. यह चैनलों / चैनल ग के संचय के लिए अनुमति देता हैtrypsinization बाद कोशिका झिल्ली पर omplexes.

4. HEK-293T कोशिकाओं में पुनः संयोजक चैनलों के electrophysiological रिकॉर्डिंग

कई व्यापक संसाधन उपलब्ध है कि सामान्य electrophysiological रिकॉर्डिंग (, 2003 Molleman जैसे Ogden और 1987 Stanfield) अंतर्निहित अवधारणाओं का वर्णन कर रहे हैं.

4.1 इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग

एक पीसी कंप्यूटर Digidata 1440A pClamp10.1 के साथ संयोजन के रूप में एनालॉग से डिजिटल कनवर्टर इंटरफ़ेस के साथ सुसज्जित, एक ठेठ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग (चित्रा 4) (Axon उपकरण, यूनियन सिटी, सीए जैसे Axopatch 200B या 700B प्रवर्धक Multiclamp) प्रवर्धक शामिल सॉफ्टवेयर (आण्विक डिवाइसेज, Sunnyvale, कैलिफोर्निया), motorized, दोहरी विंदुक (MPC-385-2, Sutter साधन कंपनी) manipulators, एक epifluorescence खुर्दबीन (Axiovert 40 सीएफएल, Zeiss कनाडा, टोरंटो, ओंटारियो) और छिड़काव प्रणाली (4 और 5 आंकड़े ). कंपन टीएमसी 63-500 श्रृंखला कंपन अलगाव तालिका (तकनीकी निर्माण निगम, पीबॉडी. एमए) पर उपकरण बढ़ते द्वारा सीमित हैं. आवारा बिजली शोर एक 40 "लंबा प्रकार द्वितीय फैराडे (टीएमसी) के पिंजरे के आसपास बिजली कंपन अलगाव मेज पर घुड़सवार उपकरण का उपयोग सीमित है. इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रण प्रणालियों (जैसे कंप्यूटर और मॉनिटर, एम्पलीफायर, एनालॉग से डिजिटल कनवर्टर, motorized जोड़तोड़ और के रूप में Valvelink छिड़काव नियंत्रण) प्रणाली फैराडे पिंजरे के बाहर एक धातु मुक्त खड़े बिजली के रैक (हैमंड विनिर्माण, Guelph ओंटारियो) के लिए मुहिम शुरू कर रहे हैं सभी बिजली के उपकरणों एक तांबे वितरक आधारित है और एक चिकित्सा ग्रेड अलगाव tranformer (1800W, Tripp लाइट में plugged. ) UL60601-1 जो ​​लाइन अलगाव, एक सुसंगत जमीन और बढ़ने दमन प्रदान करता है.

4.2 पैच pipettes

Borosilicate गिलास केशिका ट्यूब रेशा (; BF150-86-15, आयुध डिपो 1.5mm, आयुध डिपो 0.86mm, 15cm लंबाई Sutter साधन कंपनी) के साथ आधे में कटौती कर रहे हैं और में डाला एक ज्वलंत / ब्राउन micropipette डांड़ी मॉडल P-97 (Sutter साधन कंपनी) . एक कार्यक्रम विंदुक - खींचने के लिए लगातार 2 से 5MΩ जमीन के लिए इलेक्ट्रोड से (आग चमकाने के बाद, Fig.6) के बीच resistances के साथ pipettes उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित है pipettes व्यक्तिगत पॉलिश आग विंदुक टिप सतहों जो कोशिका झिल्ली के खिलाफ तंग जवानों के लिए अनुमति देता है चिकनी ( माइक्रो फोर्ज एमएफ-830, Narishige, जापान, चित्रा 6). Micropipettes headstage पर एक विशेष धारक (आण्विक डिवाइसेज, Sunnyvale कैलिफोर्निया 1-HL-U) के साथ बढ़ रहे हैं.

4.3 ग्राउंड इलेक्ट्रोड

borosilicate ग्लास ट्यूबों पैच pipettes बनाने के लिए इस्तेमाल भी संदर्भ इलेक्ट्रोड बनाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. 15cm लंबे ट्यूबों 3 टुकड़ों में काट रहे हैं. 2 ठीक इत्तला दे दी संदंश के साथ, ट्यूब एक Bunsen बर्नर लौ में आयोजित कर रहे हैं जब तक गिलास नरम हो जाता है और टयूबिंग एक 'एल' या "एक 90o कोण के साथ हॉकी स्टिक" आकार करने के लिए आमादा हो सकता है. जबकि ग्लास ट्यूब अभी भी गर्म है, एक छोर तुरंत एक गर्म 3M CSCL और 1.5% agarose समाधान है जो ट्यूब में केशिका कार्रवाई द्वारा तैयार की गई है में डूब जाता है. एक बार एक संदर्भ इलेक्ट्रोड समाधान के साथ पूरी तरह भरा हुआ है, यह ठंडे पानी की एक बीकर में रखा गया है. संदर्भ इलेक्ट्रोड के बाद सभी भर रहे हैं, वे व्यक्तिगत Kimwipes के साथ नष्ट कर रहे हैं के लिए बाहर से अतिरिक्त agarose हटायें और एक 3M CSCL समाधान में डूबे हुए हैं. 3M CSCL समाधान के साथ भरा electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए, संदर्भ इलेक्ट्रोड एक microelectrode धारक आधा कक्ष (; MEH3RF15 # विश्व प्रेसिजन उपकरण इंक, Sarasota फ्लोरिडा 90 धारक एफ 1.5mm गोली) में आयोजित की जाती हैं. (स्नान समाधान में एक जमीन इलेक्ट्रोड के चित्रण के लिए 7 चित्रा देखें)

4.4 इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग समाधान

वोल्टेज-gated आयन चैनलों के विभिन्न प्रकार के विभिन्न रिकॉर्डिंग आयन पारगम्यता / चयनात्मकता पर निर्भर करता है समाधान की आवश्यकता है. वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल के लिए, कोशिकाओं को आम तौर पर बाहरी या विभिन्न सांद्रता में बेरियम कैल्शियम युक्त समाधान में स्नान कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, invertebrate Cav3 वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल (LCav3) के electrophysiological रिकॉर्डिंग एक बाहरी पीएच 7.4 चाय-OH के साथ समायोजित के साथ 5mm 2 CaCl, 166mM tetraethylammonium (चाय - Cl), 10mm HEPES युक्त समाधान का उपयोग किया जा सकता है है. पैच pipettes CSCL 125mm, 10mm EGTA, 2mm CaCl 2, 1mm MgCl 2, 4mm MgATP, 0.3mm Tris - GTP, और 7.2 (Senatore और Spafford, 2010) की एक pH के साथ 10mm HEPES के एक आंतरिक समाधान के साथ भर रहे हैं . invertebrate एल प्रकार वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल (LCav1) एक बाहरी प्रभारी वाहक (15mm BaCl2, 1mm MgCl 2, 10mm HEPES, चाय - सीएल, 72.5mM CSCL, 40mm 10mm ग्लूकोज के साथ के रूप में बेरियम युक्त समाधान का उपयोग करके दर्ज किया जा सकता चाय-OH के साथ 7.2 पीएच समायोजित) और एक आंतरिक Cs methanesulfonate 108mM, 4mm MgCl 2, 9mm EGTA, 9mm HEPES, पीएच को समायोजित CsOH (Senatore एट अल के साथ 7.2 युक्त समाधान, 2010).

4.5 पूरे सेल रिकॉर्डिंग

  1. Coverslip ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (heterologous आयन चैनल या आयन चैनल परिसरों व्यक्त) युक्त एक 35 मिमी पेट्री प्लास्टिक पकवान बाहरी रिकॉर्डिंग समाधान के ~ 3ml युक्त स्थानांतरित कर रहा है. रिकॉर्डिंग समाधान की मात्रा सही मापा जाना चाहिए जब दवा प्रयोगों जहां दवा की ज्ञात मात्रा के लिए एक micropipette के साथ पकवान में जोड़ा जा रहे हैं प्रदर्शन. Electrophysiological रिकॉर्डिंग आमतौर पर कमरे के तापमान पर किया जाता है, हालांकि शोधकर्ता प्रयोग के आधार पर इस तापमान परिवर्तन करना चाहते हो सकता है.
  2. कक्ष एक epifluorescence माइक्रोस्कोप के माध्यम से कल्पना कर रहे हैं और एक अलग सकारात्मक ट्रांसफ़ेक्ट, पक्षपाती हरी सेल देखने के क्षेत्र के बीच में केंद्रित है.
  3. पैच विंदुक स्नान micromanipulator, जो पैच पिपेट में इलेक्ट्रोड और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच सर्किट पूर्ण का उपयोग कर समाधान में उतारा है. जबकि स्नान मोड में, pClamp10.1 सॉफ्टवेयर एम्पलीफायर का कारण बनता है छोटे दोहरा विंदुक और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच वोल्टेज कदम उत्पन्न, और एक वर्ग तरंग ट्रेस (चित्रा 8A) के रूप में जिसके परिणामस्वरूप वर्तमान प्रदर्शित करता है. यह वर्ग तरंग ट्रेस एक सेल पट्टी पहले प्रवर्धक पर ऑफसेट विंदुक का उपयोग करने के लिए चुना जाना चाहिए. विंदुक प्रतिरोध pClamp10.1 सॉफ्टवेयर के द्वारा मापा जाता है, और 2-5MΩ के भीतर होना चाहिए.
  4. स्नान मोड में हालांकि, पिपेट सेल है, जो वर्ग तरंग का पता लगाने में तेजी से उतार चढ़ाव के रूप में visualized किया जा सकता है के करीब निकटता में लाया जाता है, तो चूषण की एक छोटी राशि पैच विंदुक लागू किया जाता है विंदुक और के बीच एक gigaohm मुहर फार्म झिल्ली (वर्ग तरंग ट्रेस की एक पूरी लाइन फ्लैट का कारण बनता है, चित्रा 8B).
  5. कार्यक्रम तो पैच मोड में बंद है, और विंदुक समाई (वर्तमान के फ्लैट वर्तमान का पता लगाने के प्रमुख और अनुगामी किनारों पर छोटे blips के रूप में दिखाई, चित्रा 8B) एम्पलीफायर पर विंदुक समाई मुआवजे के साथ मुआवजा दिया है.
  6. चूषण की एक छोटी लेकिन तेज राशि पैच में झिल्ली टूटना करने के लिए लागू किया जाता है और सेल के अंदर करने के लिए इलेक्ट्रोड के उपयोग के लिए अनुमति देते हैं. सफल झिल्ली टूटना भी अग्रणी और वर्तमान लहर का पता लगाने के किनारों (चित्रा 8C) अनुगामी पर बड़े capacitive यात्रियों की उपस्थिति ने संकेत दिया है. एक बार हासिल किया गया है के माध्यम से तोड़ने, सेल मोड और पूरे सेल क्षमता मुआवजा कार्यक्रम के लिए बंद है एम्पलीफायर पर निकाला जाता है capacitive यात्रियों को हटाने है. रिकॉर्डिंग से पहले सेल में intracellular रिकॉर्डिंग समाधान के संतुलन के लिए अनुमति देने के कुछ ही मिनटों की देरी है.
  7. वोल्ट आदेशों और उत्पन्न कर रहे हैं एक Digidata 1440A pClamp10.1 सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में एनालॉग से डिजिटल कनवर्टर इंटरफ़ेस के साथ सुसज्जित कंप्यूटर का उपयोग कर डेटा प्राप्त है. अद्वितीय वोल्टेज क्लैंप प्रोटोकॉल प्रत्येक प्रयोग के लिए लिखा जाता है, और इन ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से आयन चैनल धाराओं रिकॉर्ड इस्तेमाल किया जाता है है. 9 चित्रा कैल्शियम एक HEK 293T invertebrate LCav3 वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल व्यक्त सेल से दर्ज धाराओं दिखाता है. सेल 110mV के एक वोल्टेज में आयोजित किया गया था, और और 20 mV 70mV के बीच वृद्धिशील depolarisations आवक कैल्शियम धाराओं बटोर ले जाया गया.
  8. रिकार्ड धाराओं 10, एक कम पास बेसल फिल्टर का उपयोग kHz पर फ़िल्टर्ड रहे हैं और 2 kHz के एक आवृत्ति नमूना पर डिजीटल. केवल न्यूनतम रिसाव (<10%) के साथ रिकॉर्डिंग विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, और ऑफ़लाइन रिसाव घटाव बाहर Clampfit 10.1 सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है.

4.6 दर्ज की कोशिकाओं औषधि अध्ययन

ड्रग्स सीधे दर्ज किया जा रहा है डिश में pipetted हो सकता है. दवाओं की एकाग्रता अगर दवा की मात्रा और स्नान समाधान की मात्रा जाना जाता है गणना की जा सकती है. दवा की महंगी या सीमित मात्रा में मल्टी बैरल से कई गुना microperfusion से भी जोड़ा जा सकता है एक 250 माइक्रोन हटाने योग्य टिप के साथ छिड़काव पेंसिल polyimide, या तो एक आठ चैनल Smartsquirt दबाव माइक्रो छिड़काव प्रणाली (स्वचालित वैज्ञानिक) या गुरुत्वाकर्षण प्रवाह प्रणाली Teflon वाल्व के माध्यम से संचालित का उपयोग और Valvelink8 वाल्व नियंत्रकों (वैज्ञानिक स्वचालित छिड़काव प्रणाली की व्यवस्था के लिए 5 चित्रा देखें). Microperfusion सिस्टम से फ्लो दर प्रति मिनट 0.1mL पर छिड़काव पेंसिल दर्ज सेल से 400 माइक्रोन निकल स्ट्रीम में स्थापित कर रहे हैं. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड टिप से छिड़काव पेंसिल टिप की दूरी पैच से पैच करने के लिए संगत होना चाहिए, चित्रा 10 एक सुझाव 40x बढ़ाई पर दिखाई दूरी दिखाता है. पर्याप्त प्रवाह दर दर्ज सेल के saturating छिड़काव प्रदान करते हैं. इससे पहले एक दवा का प्रयोग microperfusion का उपयोग किया है, कोशिकाओं एक सतत स्ट्रीम में नियंत्रण स्नान समाधान के microperfusion के साथ equilibrated हैं. धारा के मिनिमल रुकावट नियंत्रण स्नान, दवा या धोने समाधान से तेजी से स्विचन द्वारा प्रयोग के दौरान बचा है. रिकॉर्डिंग डिश के किनारे पर घुड़सवार सक्शन टी इस्तेमाल किया जा सकता हैओ एक सिरिंज या एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप संचालित डिवाइस (जैसे MINISTAR लघु डीसी क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पम्प, विश्व परिशुद्धता उपकरण) के उपयोग के साथ मैनुअल चूषण के माध्यम से समाधान की बाढ़, निकालना. देखभाल के बाद से बहुत तेजी से छिड़काव कतरनी बलों है कि कैल्शियम वर्तमान बदल सकता लाती लिया होना चाहिए (पेंग एट अल 2005), दूर की दर्ज सेल जा रहा धो सकता है, और दवा जलाशय भी जल्दी depletes.

सीधे पकवान बनाम छिड़काव प्रणाली में pipeting



प्रत्यक्ष pipetting माइक्रो छिड़काव प्रणाली ग्रेविटी प्रवाह छिड़काव प्रणाली
वॉल्यूम दवा की जरूरत मध्यम कम उच्च
तकनीकी कौशल कम मध्यम मध्यम
उपकरण लागत कम महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण
सेटअप और सफाई रोज़ समय कोई नहीं 20 + मिनट 20 + मिनट
उपकरणों के प्रदूषण कोई नहीं हां हां
समस्या निवारण आसान जटिल जटिल
पकवान में गारंटी दवा हां नहीं नहीं
नशीली दवाओं के अलावा के साथ सेल खो हां हां हां
बहुत कम दवा सान्द्र. धोने से कठिन सरल सरल
एक एकाधिक खुराक प्रतिक्रिया वक्र करने के आसानी इष्टतम तुलना में कम सरल सरल
परिणामों के reproducibility ठीक है - pippeting के स्थान पर निर्भर अच्छा अच्छा

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Discussion: अभिव्यक्ति और HEK-293T कक्ष में पुनः संयोजक वोल्टेज gated आयन चैनल के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अभिकर्मक रणनीति

पूरे सेल में वर्णित प्रोटोकॉल और समाधान का उपयोग धाराओं रिकार्ड करने में सक्षम होने के नाते इंगित करता है कि अभिकर्मक सफल था और वांछित वोल्टेज gated आयन चैनलों या आयन चैनल परिसरों कोशिका झिल्ली में महत्वपूर्ण मात्रा के साथ मौजूद हैं. सकारात्मक कोशिकाओं (यानी फ्लोरोसेंट) हरे चाहिए ट्रांसफ़ेक्ट हो सकता है लेकिन रिकॉर्ड करने धाराओं, 28 पर अतिरिक्त समय ° सी चैनल में ठीक और पैक किया जा प्रोटीन कोशिका झिल्ली में डाला के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक हो सकता है है नहीं. 28 पर है कि लंबे समय तक ऊष्मायन नोट ° सी कोशिकाओं coverslips से अलग करने का कारण बनता है, और झिल्ली को अस्थिर करने और मृत कोशिकाओं से मलबे जमा, पैच दबाना रिकॉर्डिंग और अधिक चुनौतीपूर्ण बना. इस प्रोटोकॉल में सुझाए गए समय के सभी हमारे विशेष चैनलों के लिए अनुकूलित किया गया है. अन्य चैनलों और उनके सब यूनिटों को अब या कम ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है सकते हैं, और हमारे प्रोटोकॉल आगे के रूप में की जरूरत है समायोजित कर सकते हैं. कुछ चैनलों के लिए गरीब अभिकर्मक दक्षता (यानी कम फ्लोरोसेंट कोशिकाओं और सेल प्रति कम प्रतिदीप्ति तीव्रता) कुशलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट, अत्यधिक फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की तुलना में बेहतर परिणाम पैदा करता है. चाहिए कोशिकाओं फ्लोरोसेंट हो सकता है लेकिन रिकॉर्ड करने धाराओं, समस्या निवारण के लिए शामिल बिंदुओं पर विचार नहीं: गौण प्रोटीन (ओं) की कमी, अनुचित अभिकर्मक अभिकर्मकों के मिश्रण, उप इष्टतम समाधान रिकॉर्डिंग, और उत्परिवर्तन / चैनल या चैनल के पुनर्संयोजन सीडीएनए अनुचित तरीके से उत्पादन constructs सबयूनिट मुड़ा हुआ या गैर व्यक्त चैनल.

1 आंकड़ा
चित्रा 1: मानव भ्रूण गुर्दे 293T कोशिकाओं (HEK-293T) पक्षपाती monolayers में CO2 इन्क्यूबेटरों में दिए 25cm2 बोतल में 37oC (5% सीओ 2) में बड़े हो रहे हैं 90 confluency% और 01:12, 01:08 और 01:04 पर विभाजित dilutions. कक्ष आम तौर पर द्वि - साप्ताहिक ~ 90% confluency से विभाजित कर रहे हैं. ~ 90% समान बंटवारे पर confluency सुनिश्चित करने के लिए, कोशिकाओं 01:08 कमजोर पड़ने में सोमवार को विभाजित कर रहे हैं, और गुरुवार पर 1:12. अभिकर्मक करने के लिए, पहले एक नया फ्लास्क में एक पूरी तरह से मिला हुआ फ्लास्क 01:04 विभाजित है, और कोशिकाओं के लिए एक CO2 इनक्यूबेटर में 37oC पर 3-4 घंटे के लिए देते हैं अनुमति दी जाती है.

चित्रा 2
चित्रा 2: HEK-293T में आयन चैनल की heterologous अभिव्यक्ति के लिए रणनीति (बाएं) आयन चैनल cDNAs प्लाज्मिड pIRES2-EGFP के कई क्लोनिंग साइट में क्लोन कर रहे हैं . (सही) और EGFP कोडन अनुक्रम (हरा), HEK mRNA अणुओं से युक्त आयन चैनल अनुक्रम कोडन (लाल) एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट के बस नदी के ऊपर (नीला IRES) के उत्पादन में कोशिकाओं के परिणाम में इन constructs के अभिकर्मक. आयन चैनलों अनुवादित कर रहे हैं और ईआर और endomembrane प्रणाली के माध्यम से कोशिका झिल्ली के लिए shuttled हैं, जबकि EGFP अनुवादित है और cytoplasm में बनाए रखा.

चित्रा 3
चित्रा 3: अभिकर्मक और heterologous HEK-293T कोशिकाओं में आयन चैनल cDNAs, और electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए coverslips पर कोशिकाओं के चढ़ाना की अभिव्यक्ति (ए) (शीर्ष पैनल) HEK-293T कोशिकाओं 28 में incubated सी, चार दिन के साथ के बाद अभिकर्मक LCav3 कैल्शियम pIRES2 EGFP स्तनधारी सीएमवी अभिव्यक्ति वेक्टर में harbored चैनल. (नीचे पैनल) ऊपर कोशिकाओं trypsinized और गिलास coverslips पर मढ़वाया, electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अलग. अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (डीआईसी).

आंकड़ा 4
चित्रा 4: एक ठेठ electrophysiological रिकॉर्डिंग रिग सेटअप electrophysiological रिकॉर्डिंग रिग घटकों एक एम्पलीफायर (ए), एक पर्सनल कंप्यूटर (पीसी), Digidata 1440A एनालॉग से डिजिटल कनवर्टर इंटरफ़ेस (सी), motorized, दोहरी विंदुक manipulators (प्रधानमंत्री) शामिल हैं , एक epifluorescence माइक्रोस्कोप (एम), छिड़काव प्रणाली (पी), टीएमसी 63-500 श्रृंखला कंपन अलगाव तालिका (VT), 40 लंबा प्रकार द्वितीय फैराडे पिंजरे (एफसी), और एक मुक्त खड़े 19 धातु, बिजली के रैक (नि.).

चित्रा 5
चित्रा 5: परफ्यूज़न प्रणाली (ए) एक गुरुत्व प्रवाह प्रणाली Teflon वाल्व और Valvelink8 नियंत्रकों का उपयोग कर संचालित. (बी) के आठ चैनल Smartsquirt दबाव माइक्रो छिड़काव प्रणाली. मल्टी बैरल या तो छिड़काव प्रणाली के कई गुना टिप एक motorized जोड़तोड़ पर मुहिम शुरू की है.

6 आंकड़ा
चित्रा 6: पॉलिश, पैच (बाएं) 10x और 40x बढ़ाई (दाएं) पर दिखाया pipettes पैच pipettes रेशा और विंदुक टिप सतहों चिकनी पॉलिश आग के साथ borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब से उत्पन्न किया गया . एक विंदुक खींचने कार्यक्रम pipettes है कि हमारे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेट अप में 2-5MΩ पढ़ने दिया उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया गया था.

"Alt =" 2314fig7.jpg 7 / आंकड़ा ">
चित्रा 7:; रिकॉर्डिंग समाधान में ग्राउंड इलेक्ट्रोड और रिकॉर्डिंग डिश में पैच pipettes पैच विंदुक (दाएं) और जमीन इलेक्ट्रोड (सफेद तीर बाएं).

8 आंकड़ा
चित्र: 8 pClamp10.1 स्क्रीन शॉट्स एक पैच बनाने के चरणों illustrating (ए) स्क्वायर लहर ट्रेस मनाया जब नहाने के मोड में . (बी) पैच मोड में एक Gigaohm सील फ्लैट वर्तमान का पता लगाने के प्रमुख और अनुगामी किनारों पर वर्तमान के छोटे blips के रूप में दिखाई समाई विंदुक के साथ वर्ग तरंग का पता लगाने का एक सपाट होता है. (सी) और सेल मोड में सफलता देर के बाद, बड़े capacitive यात्रियों में देखा जाता है.

9 आंकड़ा
चित्र: 9 इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी परिणाम (बाएं) रिकॉर्ड आवक वोल्टेज gated कैल्शियम धाराओं सफल अभिकर्मक और heterologous आयन चैनल की अभिव्यक्ति (LCav3 उदाहरण के लिए) इंगित करता है. (राइट) Untransfected कोशिकाओं कोई रिकॉर्ड करने धाराओं है. कक्ष एक चतुर्थ प्रोटोकॉल है कि निर्दिष्ट करता है कि सॉफ्टवेयर में 110mV सेल पकड़ और फिर 250msec के लिए-70mV फिर वापस 110mV संभावित नीचे पकड़े कदम के अधीन थे. हर बार कदम 10mV द्वारा इतनी बढ़ जाती है कि कदम के लिए 70mV, 60mV आदि कर रहे हैं जब तक अंतिम चरण के 20 mV है. परिणाम एक invertebrate टी प्रकार (Cav3) एल stagnalis से वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल homologue के लिए कर रहे हैं LCav3 करार दिया.

10 आंकड़ा
चित्रा 10: (ए) इलेक्ट्रोड और रिकॉर्डिंग समाधान में microperfusion पेंसिल की व्यवस्था पैच pipettes borosilicate ग्लास (दाएं) से तैयार की जाती है और मल्टी बैरल दवा छिड़काव के लिए कई गुना टिप (बाएं) polyimide. Borosilicate ग्लास के ग्राउंड (वापस) इलेक्ट्रोड 3M CSCL और 1.5% agarose समाधान के साथ भरा तुला के रूप में हॉकी स्टिक microelectrode धारक त्रैमासिक - कक्ष में आयोजित है. (बी) छिड़काव पेंसिल टिप और रिकॉर्डिंग microelectrode के एक माइक्रोस्कोप के माध्यम से 40x दृश्य.

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Disclosures: अभिव्यक्ति और HEK-293T कक्ष में पुनः संयोजक वोल्टेज gated आयन चैनल के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अभिकर्मक रणनीति

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: अभिव्यक्ति और HEK-293T कक्ष में पुनः संयोजक वोल्टेज gated आयन चैनल के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अभिकर्मक रणनीति

इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और जदएस के लिए डिस्कवरी ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च () NSERC परिषद, एक NSERC अलेक्जेंडर ग्राहम बेल कनाडा ग्रेजुएट छात्रवृत्ति (डॉक्टरेट) (ए Senatore) और दिल और स्ट्रोक फाउंडेशन अनुदान 6284 # NA में सहायता.

Materials: अभिव्यक्ति और HEK-293T कक्ष में पुनः संयोजक वोल्टेज gated आयन चैनल के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अभिकर्मक रणनीति

Name Company Catalog Number Comments
pIRES2-EGFP plasmid Clontech Laboratories 6029-1
Circle glass coverslips Fisher Scientific 12-545-80 Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm
Amplifier Axon Instruments Axopatch 200B or Multiclamp 700B
Data Acquisition System Axon Instruments Digidata 1440A
Electrophysiology Software Axon Instruments pClamp10.1
Pipette manipulators Sutter Instrument Co. MPC-385-2
Epifluorescence inverted microscope Carl Zeiss, Inc. Axiovert 40 CFL
Headstage Axon Instruments CV-7B
Headstage electrode holder Axon Instruments 1-HL-U
Microelectrode holder for ground electrode World Precision Instruments, Inc. MEH3RF 15
Electrophysiology capillary tubes Sutter Instrument Co. BF-150-86-15 Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Micropipette fire polisher Narishige International Micro Forge MF-830
Micro drug perfusion system AutoMate Scientific, Inc. SmartSquirt8 Valvelink8.2
Drug perfusion system AutoMate Scientific, Inc. Valvelink8.2 with Teflon valves

References: अभिव्यक्ति और HEK-293T कक्ष में पुनः संयोजक वोल्टेज gated आयन चैनल के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अभिकर्मक रणनीति

  1. Thomas, P., Smart, T.G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51, 187-200 (2005).
  2. Senatore, A., Spafford, J.D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis Journal of Biological Chemistry 285, 7447-7458 (2010).
  3. Senatore, A., Boone, A. N., Lam, S., Dawson, T. F., Zhorov, B. S., Spafford, J. D. "Mapping of dihydropyridine (isradipine) binding residues in a less sensitive invertebrate L-type calcium channel (LCav1)". (submitted).
  4. Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. In: Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook, 2nd edn. The Company of Biologists, Cambridge (1987).
  5. Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. John Wiley & Sons Ltd., England (2003).
  6. Peng, S-Q, Hajela, R.K., Atchison, W.D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research 1045, 116 - 123 (2005).

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4 Comments

Dear,

I'm intreged by the fact that 28°C could help the transfection. Is there a known reason? Bettere translocation to the membrane? I'm asking because i'm trying to transiently transfect an ionchannel into HEK293T cells with the ultimate goal to generate a stable cell line, expressing these channels

Thanks and kind regards

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Posted by: Daniel J.May 10, 2012, 9:47 AM

Hi, at 28°C, HEK293T cells are less likely to divide than at 37°C. You leave HEK293T cells at 28°C to promote protein production, and they also remain adherent to cover slips. - David Spafford

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Posted by: AnonymousMay 10, 2012, 10:36 AM

Dear prof. dr. Spafford,
I'm trying to prepare HEK cells to express a (human) voltage gated ion channel and find to have difficulties to let them express. The qualtity of cells is low and using imaging techniques there isn't much of expression noticable. The ultimate goal would be to use HEK in automated population patch. I find your article very interesting, the 28°C methode intreging, so...would you think this could improve expression significantly? Could we use Accutase instead of trypsine, and Fugen transfection. We're using T75 flask, what confluency or cell density would you suggest prior to transfection?
I do apologize for all my questions

Thank you in advance

Kind regards

Daniel

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Posted by: Daniel J.May 25, 2012, 4:20 AM

HEK cells may lack a protein that promotes expression of your ion channel. A high quality and purity of prepped cDNA is a key factor in the expression efficiency of transfected ion channels. The protocol that we include is one that works for us. Deviations from this protocol may not lead to satisfactory results.- David Spafford.

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Posted by: AnonymousMay 25, 2012, 5:32 AM

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