膜电位，突触反应，神经回路，神经调节和肌肉组织学用小龙虾：学生实验室练习

Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322, doi:10.3791/2322 (2011).

本报告的目的是帮助开发一个跨生物细胞膜的离子梯度造成的影响的认识。影响细胞的膜电位，并在这些实验中，我们处理的两个方面是：（1）膜^外的K +离子浓度，（2）对特定离子的膜通透性。小龙虾腹部伸肌一些补品（慢）和其他阶段性在其生化和生理的表型（快），以及在其结构的分组，支配这些肌肉的运动神经元功能特点也相应不同。我们使用这些肌肉，以及浅，补虚的腹部屈肌证明突触传递的属性。此外，我们引进一个感觉中枢神经系统，运动神经元肌肉电路，演示电路的某些方面的表皮感官刺激的效果以及神经调质的影响。在这次演习中获得的技术，就可以开始回答许多问题，在其他实验的准备工作以及在相关的医学和健康的生理应用的剩余。我们已经展示了模型的无脊椎动物制剂的实用性，以解决有关的所有动物的根本问题。

1。简介

这些实验室练习的目标是理解兴奋膜的性能，静息膜电位的离子基础和方法来衡量的膜电位。此外，染色和肌肉组织学，它可以用来教的肌肉结构。此外，两个不同类型的解剖筹备工作，是用来证明突触传递的属性在不同的肌肉群。一个完整的感官中央神经系统（CNS）的电机在小龙虾腹部神经肌肉电路也可用于呈现出准备研究的感官刺激和neromodulators和电路方面的神经递质的影响。

本报告的第一部分介绍的方法用来测量静息膜电位和细胞外^K +膜电位的影响。我们还将推出肌肉的结构。在这次演习的第二部分，我们目前测量从不同类型神经肌肉接头（NMJs）的突触反应的各种手段。第一个练习中使用的小龙虾腹部的伸肌和第二个使用腹部浅屈肌肌肉。此外，我们目前的神经电路（与感觉输入和电机输出的小龙虾的腹神经索），易于维护，并且可以用于教学，以及用于研究的一个感觉，中枢神经系统的各个方面 - 运动神经元肌肉电路。完成初始演习的解释后，我们目前NMJs和中枢神经系统电路的生理机能。

跨生物细胞膜的离子梯度可以导致电位差。对于处于静止状态的细胞中，这种差异在穿过细胞膜电荷被称为细胞的静息膜电位。有两个主要因素，我们将针对影响细胞的膜电位。首先是膜两侧的离子浓度。第二，是细胞膜的离子渗透性。重要的是要记住，在活细胞中也有不同的离子与细胞内外的浓度不同。我们将讨论的主要离子是钠（ ^钠离子），钾（K ^+）和氯（CL -）。跨肌膜这些离子的数量和运动决定的膜电位。在此基础上，，我们可以解决电激励和抑制膜从突触反应时观察到的电势和研究药理制剂的影响。我们还可以建立生物物理模型实验测试的概念“（Robinson等。，2010），代表这些过程。

使用证的玻璃毛细管微电极记录膜电位。插入电极，可通过细胞膜无损坏，提供的提示是足够小的和可以得到准确测量跨膜电位。该技术特别适用于大型的细胞，这是不太可能是由细胞内的电极插入损坏。这是生理的基本技术之一。

穿过细胞膜+ Na +和K的平衡是维持生理条件下的钠钾ATP酶泵。在正常情况下，平均泵移动，三钠离子出细胞和两个K +进入细胞。作为一个方面说明，早在1950年代后期，这一发现于1997年被授予诺贝尔化学奖。获得使用轴突从蟹（斯科，1965年，1998年）的研究发现基本面。

该泵也被认为是electrogenic，因为它有一个更大的泵时，膜去极化能力（斯科，1989，B）。在许多细胞中，泵的速度，当一个细胞电去极化激活。

钾钾“泄密”的渠道也可以将通过而细胞是处于休息状态。由于这些钾泄漏通道，在休息的细胞膜钾比等离子更渗透。因此，细胞的静息膜电位比钠钾平衡电位。静息膜电位，然后可以检查，看它是否取决于钾平衡电位时。

1）肌肉变性

甲壳类肌肉纤维表现出更大的的结构特征，膜的电性能和收缩性能比脊椎动物的肌纤维变性。甲壳类动物中的阶段性肌纤维抽搐型收缩修改。它们的特点是短肌节长度（2-4微米），薄，直的Z -线，薄到厚的肌丝的比率低，和发达的T管和肌系统网。有阶段性的肌纤维膜，可能会产生动作电位梯度或全或无。调和肌肉纤维，另一方面，修改为紧张的长期维护。他们通常有10至15微米，厚，波浪状的Z -线，高比例的薄到厚的肌丝，T型管和肌浆网系统不太发达的肌节长度。调和肌肉纤维膜往往是​​电inexcitable，或他们可能会产生等级的电反应（“分级尖峰”）。甲壳类动物的肌肉中发现一个广泛的中间纤维类型。

2）方程

常用方程来确定离子和静息膜电位的平衡电位能斯特方程和高盛霍奇金卡茨（GHK）方程。两个方程之间的一个重要区别是，能斯特方程只能用于一个特定的离子，以确定该离子的平衡电位，而GHK方程是用来确定考虑多个离子及其梯度的通透性跨静息电位细胞膜（斯特，1888年，1889年，高盛，1943年，霍奇金淋巴瘤和赫胥黎，1952年霍奇金等，1952;霍奇金淋巴瘤和Katz，1949年;看到Hille，1992年）。

跨越膜产生电动势，通常显示为的离子被普遍认为是能斯特方程：

V =（RT / ZF）LN（[X] _出 / [X]）

X =离子的利益
V =为X离子平衡电压穿过细胞膜
R =气体常数[8.314 J /（摩尔•K）]
T =绝对温度开尔文]
Z =离子的化合价
F =法拉第常数[9.649 × 10 ⁴ / MOL]

对于K ⁺离子在20 ° C和LN改造登录填写的常量₁₀沿，一到达：

在mV表示潜在= 58日志（/ [ _出 K] [K]）;

让我们假设，只有K ⁺扩散permeant。 [K]是K ⁺浓度的细胞和_[out K]内的K ⁺浓度对细胞外。

作为一个运动估计[K]。 ______________

假设此计算，膜电位是只依赖的K ⁺平衡电位。

_[K掉] =使用生理盐水是5.4毫米。另外，假设膜电位为- 70mV。

潜在= 58日志（/ 5.4 [K]）。

在实验中，我们将测量细胞的静息膜电位，并确定它是如何改变[K]的影响。有关的假设_出膜电位和[K]的坡度为58 。在不同的休息膜电位_[出K]（范围从5.4毫米至100毫米）收集数据后，我们将绘制的观测值，以确定是否有一个假想的线匹配。我们将使用5.4毫米_[K掉的平均静息膜电位发起的假设和观察到的的行进行比较。

考虑膜可以渗透到超过之一离子在休息时，以及在不同的去极化状态，使用GHK方程，考虑到各种离子的通透性（公式中的p）。 GHK方程将降低到能斯特方程，如果膜是可渗透到只有一个离子。

这里是一个广义GHK方程的Na ^{+，K +}和Cl ^-离子：



由于氯^-有一个负电荷，浓度长期倒在这内外方程。这使得Z轴（离子电荷）要离开的。

3）这次演习的目的

在这个实验中，我们将衡量一个小龙虾肌细胞的膜电位，并适用于上面讨论的解决原则：

1. 如何来衡量一个适当的仪器和技术的细胞膜电位。
2. 肌细胞膜离子通透性，它有助于膜电位。
   
   此外，我们会做的肌肉结构的初步研究：
3. 使用污渍突出，在背的小龙虾腹部，这是用来进行电生理实验方面的肌肉解剖。
4. 检查的不同类型的肌纤维组织学。

在这个实验室工作，我们将使用小龙虾腹部的伸肌。在过去的生理学教授这些原则已被用于这准备ð解剖（阿特伍德和帕纳斯，1968年）。我们使用了很多从这个来源和修改其他程序，以适应目前的仪器和一个3小时的学生实验室期间完成的目标。这些演习是在生物系动物生理学在肯塔基大学（博士导师RL库珀，2010）的过程中使用的其他实验的基础。

4）为什么这个模型动物

在本实验中使用的小龙虾腹部伸肌有几个很好的理由：

1. 小龙虾是常用的，在实验室条件下的相对便宜和易于维护。
2. 夹层是供学生学习解剖现场的准备工作技术相对容易。
3. 肌肉是稳定在一个最小的生理盐水可以很好地为学生学习电生理技术的几个小时。肌肉的准备是相当强劲，当外部K +短时间内改变。
4. 各种突触反应，可以很容易地获得通过刺激运动神经元。
5. 伸肌解剖安排很容易辨别，由于其大尺寸，它是相对容易获得稳定的细胞内录音的。
6. 肌肉和神经支配模式，可以很容易观察与亚甲蓝染色。此外，特别是肌纤维类型可以很容易处理，组织学观察肌节的结构。
7. 没有动物的协议都需要在这个时间在美国境内的各项准备工作在许多机构的实验室试验中的无脊椎动物动物。

2。方法

1）材料

• 剪刀（1）
• 钳（1）
• 银线为地线（1）
• 显微镜（1）
• 电极针（1）
• 培养皿的底部（1）与Sylgard
• 盐溶液（1）
• 钾的解决方案：5.4mM（生理盐水），10，20，40，80，100毫米
• 漂白剂（少量使用银线的一角建立AG - CL）
• 玻璃吸管（1），删除和添加的解决方案
• 注射器（1）
• 放大器/采集系统（1）
• 法拉第笼（1）
• 台式机/笔记本（1）
• 夹层引脚（4）
• 小龙虾

2）方法

2.1）的制备/夹层：

1. 应该得到一个小龙虾在车身长度约6-10厘米（或管理的大小）。按住后脑勺的小龙虾，大约从后面的眼睛厘米。确保小龙虾或它的嘴爪不能达到个人处理的小龙虾。 （小龙虾可能被放置在碎冰5分钟前麻醉，切断头。）
2. 使用大剪刀，迅速取出头。做一个从落后的小龙虾眼睛的清洁和快速切割。处置的头部和附属物。
   
   图1。图像显示切的位置，以消除小龙虾的头部。
3. 在这一点上，以避免受伤的腿和小龙虾爪可以切除。男性和女性对男性和游泳的触控也可以被删除（图2）。接下来，从胸部腹部分开。请加入的腹部和胸部（图3）沿关节膜削减。小龙虾的腹部部分保存和处置的胸部。
   
   图2。剪刀切割口针。可以从这些小龙虾。
   
   图3。图像显示切的位置，以消除腹部胸部。
   
   图4。去除胸部，腹部。切割应沿直线段加入循环的方式。
   
   图5。顶部图像显示腹部游泳足附属物。底部图像显示无腹部游泳足的附属品。
4. 随着腹部，切应沿下腹部两侧的外侧缘，在shell。应采取不太深切成小龙虾。为了帮助在切削壳过程中，切应指向轻视对腹侧方和一个角度剪刀。按照行运行的每个段的长度（图6）小龙虾的天然贝壳图案。
   
   图6。剪刀斜着和遵循自然对齐的外壳。不要剪太深，破坏的准备。沿各段应削减的自然行头指向箭头。
5. 取出腹壳部分。小心不要破坏腹肌。用钳取出腹部分。当腹壳的部分被删除，白色群众的组织，可以看到深屈肌的肌肉上。这个组织可以用镊子小心被删除。
   
   图7。钳取出腹壳部分。拉起和背部的腹侧部分删除。不要破坏肌肉的腹壳下。
   
   图8。拉动腹侧部分是被丢弃的外壳。
   
   图9。准备用剪刀剪下的腹侧部分并丢弃。
6. 胃肠道，一个小管，沿中线的深屈肌肌肉运行，可以去除小龙虾。捏住与钳道的顶部，并从腹部拉。 - 在尾端切道底部。用生理盐水冲洗清扫，以确保粪便不干预的准备。
   
   图10的图像显示了清除胃肠道从筹备。
7. 使用夹层引脚，以确保编制的培养皿。编制的顶部和底部的边角应牵制菜。盐溶液应倒入培养皿中，并完全覆盖的准备，执行，直至细胞内的录音。
   这清扫菜应该有一个底部Sylgard（道康宁）涂层（1cm厚），使昆虫引脚可以把它卡住。
   解剖的准备沐浴在标准的小龙虾生理盐水，范Harreveld的解决方案（1936年），这是205氯化钠修改; 5.3KCl; 13.5 _{氯化钙2 ·} 2H ₂ O; 2.45 _{氯化镁2 ·} 6H ₂ O 5 HEPES调节pH 7.4（毫米）。

2.2），细胞内记录

图11。录音设备的总体格局。

8. 应与准备的培养皿放在显微镜下，在蜡盘，以防止运动的底部担保。
   
   图12。准备在显微镜下的位置。用蜡，以确保在培养皿和准备。
9. 应获得两个线，银线的一端连接到每一个长度短。银线，应到少量的漂白剂浸泡20分钟左右，获得的Ag - CL涂层。使用前，用清水洗净线。一个细胞内的玻璃吸管应获得并仔细回填，长针与3M KCl溶液填补了注射器。移液器应拒绝开放面临的地板和填补与解决方案。这将确保，任何多余的氯化钾将滴灌电极背面。要确保没有氯化钾运行沿玻璃吸管将进入盐水浴。氯化钾溶液灌装完成时，打开移液器直立。银线，然后可以放入吸管。另一端连接到放大器头阶段的+（正）极。移液器，然后固定在电极针。应当作出不打破电极尖端。第三线连接到法拉第笼应放入绿色竿头阶段。最后剩余的铅银线应放置在洗澡时，另一端连接到 - （负）极图所示。电线也应放在从法拉第笼的AD转换器PowerLab系统的地面部分。头阶段是收购/放大器（PowerLab系统）连接到“输入探头。
   
   图13头阶段配置。连接头阶段的绿色输入线是接地的放大器或法拉第笼。红色输入连接线连接到电极丝。黑色的输入是用于连接到沐浴解决方案。
   
   图14。“测试拨动”是测试电极resistance.The“粗”旋钮也发现，在最后一行根据直流偏移应把计数器的时钟明智。增益设置为50，信号放大系数五十。从头部阶段的接地线被放置在“GND”的针插孔开幕。
10. LabChart软件应打开台式机或笔记本上。调整图表显示只有一个通道，通过点击“设置”，然后，“通道设置”。根据“频道设置”，更改号码渠道之一。点击“确定”。在图表的上方，左上角，每秒的周期应该是2K。设置伏特（Y轴）大约为200mV到500mV的。点击“通道1”就在屏幕的右手部分。点击“输入放大器。”确保差分框被选中。
    
    放大器的输出应在渠道之一。放大器应采用以下设置：
    • 高通直流
    • 陷波器关闭
    • 低通- 20KHZ
    • 逆时针容量比赛.-
    • 直流偏移的精细和课程旋钮逆时针
    • 直流偏置（关） - 关
    • 增益旋钮- 50
    • 输入（DIFF单声道GND） - 差速器
    • 模式（刺激栅极REC） - 拍摄
    • ΩTEST- OFF
11. 作为一个电极电阻的测量，电压除以电流，这是2.0 NA（即R = V / I，或欧姆的法律）。结果值玻璃电极的电阻。电阻应20至60 MegaOhms。下（<20）和高电阻（> 100）是不能接受的。一旦阻力已经确定，细胞内的录音就可以开始。玻璃电极放置到盐水浴的提示。确保地线也是在盐水浴。
    要开始录制，按在屏幕底部的开始。确保在增益设置为5 V /格。使用放大器的当然旋钮移动LabChart零线，然后再插入电极。切换旋钮，应先关闭，然后关闭几次，以测试电极电阻。接下来，所产生的值的幅度应测量。稳定的底线上放置一个标记，然后放置在高峰第二，获得的电极电阻。
12. 使用的电极探针和显微镜插入电极的纵肌的准备（DEM或DEL1或警报2动作延迟时间）（见图16）。勉强电极插入肌肉。不要穿透肌肉。使用显微镜和探头设置，以便找到纵肌和电极插入肌肉。高强度照明灯应调整作为电极被插入清楚地看到肌肉。时戳在这准备的肌肉纤维，通常可以运行到空格和肌肉内裂。这是为什么膜电位可能会出现，然后消失，然后重新出现的原因。
    
    图15。电极插入肌肉。
13. 要测量膜电位，使用放大器上的粗旋钮移动LabChart零线，然后再插入电极。捅了肌纤维。接下来，测量值的幅度。稳定的底线放在一个标记和记录的价值。
    在标记和活动光标的区别是显示在屏幕的右侧。该值给出的电压。记录电压，可能需要分（即10倍或100倍的放大）放大放大器上的使用量。毫伏（1 V = 1000 MV）从伏电压应该是转换，如果值是软件作为伏报告。
14. 小心地使用显微镜和操纵者，从肌肉中删除的电极。打个招呼另一个肌纤维和注意静息膜电位。人们应该采取一些录音和措施以及指挥利益的肌纤维间的电极与舒适。
    电极可能不会停留在一个肌纤维在所有不同的改变[K ^+]出解决方案变化。最好是退出电极，然后改变的解决方案，然后渗透，以避免损坏肌肉。最好是从不同的肌纤维获得3％溶液的读数和使用，以避免任何虚假的读数平均。
15. 使用注射器，删除和丢弃的盐溶液的培养皿。下一个更高的氯化钾盐溶液的浓度，完全覆盖了准备，应填写培养皿。每个钾溶液，并应重复同样的过程，应注意并记录电压/潜在的变化。系列K ⁺小龙虾，我们使用的盐溶液：5.4，20，40，60，80，100毫米。

2.3）解剖

现在的生理完成后，我们可以检查相关的解剖的肌纤维和神经支配模式。转移的准备染色菜和添加亚甲蓝亚甲蓝小龙虾生理盐水100毫升混合（1克）。让盐水洗澡5分钟的准备，然后取出并添加新鲜的小龙虾没有污点生理盐水。这些肌肉的解剖结构已多年来（赫胥黎，1880年的朝圣者和Wiersma，1963年）中详细。直到最近，部分肌肉被描述解剖结构，生理和生化（Cooper 等人 ，1998年; Griffis 等，2000;孙某等人，2000）。

一般的肌肉解剖布局是描绘在图16（图右侧为这个目的）。寻找主要的神经支配主要是段内的肌肉。画出的扫描电镜，警报2动作延迟时间，警报1动作延迟时间段DEM肌肉的神经支配模式。腹部需要捉襟见肘，完全寄希望于准备的菜坚决。接下来删除生理盐水和添加固定液。修复方案是一个Bouin氏液（饱和苦味酸，甲醛和醋酸准备;的Sigma - Aldrich公司）。

谨慎。不要你的皮肤上或在你的眼睛的这个解决方案 。 通风柜下工作，避免解决方案的蒸汽 。 如果你的眼睛开始燃烧洗你的眼睛立即洗眼站。

让Bouin氏液保持在约10分钟的准备，然后用吸管和生理盐水交换解决方案。切警报1动作延迟时间或警报2动作延迟时间的肌肉出了薄薄的一片，并将其放置在玻片上。标签的幻灯片。重复的SEM肌肉的程序。查看这两个组织的筹备工作中的肌带型。您可以使用复合式显微镜，并相应调整的目标，看到的带型。如果可能的话，通过显微镜的目镜数码照片（注：一些手机摄像头的工作此过程）。

图16：从背部分的小龙虾腹部各分部的伸肌肌肉的腹面观的示意图。背膜的腹部肌肉（DMA）和浅层伸肌辅助呼吸肌头（SEAcc）发生在段1 5腹部为每个细分市场的不同的方向。段1的异常，这些肌肉都在其前结束钙化的背片和关节膜后结束他们的附着点。在段1，同源肌肉有其前位于胸部和腹部之间的关节膜的附着点。画像是根据摄影蒙太奇的亚甲蓝染色的准备。在图的左侧，所有的深伸肌已被删除，显示浅表背伸肌。规模= 2.35毫米。 （从孙某等人，2000年）。

3。结果

下面的问题和数据处理说明了这个实验室程序的主要原则和目标。

1. 绘制在每个[K ^+] _出用于静息膜电位的措施。看看所观察到的和假想的线在其斜坡匹配的。要绘制的值与X轴使用一个半对数图，不同^的 K +日志和Y轴的膜电位（如下图所示，图17） 。 （免费下载图形文件，如果需要 http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ ）
   
   方格纸图17。
   使用5.4毫米获得的平均静息膜电位[K ⁺出发起的假设和观察到的的行进行比较。
   如果行不匹配的讨论，这可能是为什么。
2. 如果你改变了Na ⁺离子的外部电平，你会期望改建的相同类型的观察改变^的K +浓度？
3. 如何亚甲蓝染色相比，神经肌肉？为什么会出现分歧？亚甲蓝用于在活的人体细胞组织或对比识别今天吗？与弗洛伊德和使用中的小龙虾的污渍有什么关系？
4. 注意之间的DEL和SEM肌肉的肌模式任何分歧。如果是这样，可能是什么原因呢？所有的肌肉都具有​​相同的休息肌距离吗？画出你用显微镜，并尽可能称为肌肌肉解剖图多的标签上所观察到的肌肉带型。

4。测量突触重sponses

1）引言

腹部伸肌准备用来证明静息膜电位也展示从各种肌肉NMJs诱导突触反应理想。在甲壳类动物的某些肌肉有选择性地由一个阶段性或一剂强心剂运动神经元支配，阶段性和补品兴奋的运动神经元，如伸肌腿走路的小龙虾（阿特伍德，2008年，虽然有些单一纤维可支配;看到朱庇特生产ID＃2319吴和库珀，2010）和大多数其他肢体肌肉（Wiersma，1961a）。通过选择性地刺激运动神经元的阶段性和补品，可测得生理上的差异在EPSPS。阶段性的运动神经元产生快速抽动的肌肉纤维和唤起10-40毫伏的顺序EPSPS。阶段性的反应，能迅速抑制5 - 10 - Hz的刺激列车。进补的运动神经元产生较小的，可在更高频率的刺激（10-50赫兹）的存在促进EPSPS。结构，突触前的阶段性和补品在NMJs终端是不同的（阿特伍德和Cooper，1996; Bradacs等，1997;。Cooper等人，1998年） 。

令人惊讶的是阶段性生理反应的表型，可以进行电空调阶段性的神经元为7天，每天几个小时的改造，以一剂强心剂般的状态（Cooper等人，1998年; Mercier和阿特伍德，1989年）。转化NMJs神经调节的灵敏度是调查受体表达的调控（Griffis等，2000）的总理。

在这种相对强劲的准备（小龙虾腹部肌肉），补品和阶段性的反应很容易记录和便利化和/或抑郁症与不同刺激范式的突触反应的研究。有了这些准备，学生将能够认识到通过刺激神经束的阶段性和补品的突触反应的泛泛而谈。

提出一个额外的NMJ准备用于监测从中枢神经系统的内在动力的活动和感官刺激引起的电机活动。这是小龙虾腹部的腹面浅屈肌。这种准备也将被用来监视感官电路的中枢神经系统，电机肌肉和神经调质（ 斯特朗等人，2000年）的影响。

在腹段（除了最后一个），每个组肌肉的功能有三个：（1）这些控制腹足（游泳足）运动，（2）三个伸肌和（3）三个屈肌肌肉。屈肌和伸肌的肌肉，或者腹部前屈或扩展，造成约段间的铰链的转动带来的对立群体。阶段性肌肉占大多数腹部的体积，而滋补肌肉包括跨度的背（伸）和每个腹节腹面（屈肌）方面的纤维薄片。

小龙虾，小龙虾腹部的补药屈肌肌肉神经支配的每半段由5个运动神经元和外围设备的抑制神经元。作为一种神经递质谷氨酸的兴奋性运动神经元使用。谷氨酸去极化的肌纤维，导致通透性增加，主要是钠离子。抑制性神经元释放γ-氨基丁酸（GABA），这通常hyperpolarizes造成氯离子的通透性，增加肌肉纤维。在某些甲壳类动物的肌肉（主要是四肢），外围的抑制性神经元突触联系与运动神经元的终端以及与肌纤维，和减少运动神经元（突触前抑制）（Dudel Kuffler，1961年公布的发射机的数量）。这种现象是不是在目前小龙虾的滋补屈肌肌肉。

小龙虾的腹神经索是两侧对称的结构，运行长度的动物。每体节有一节。在腹部（6段），每节包含几百个神经元，并每两个连接词几千轴突组成。神经细胞体上的每个神经节腹面厚形成一层几个细胞组织。紧随细胞体层以上​​罚款的神经元突起的小梁，neuropile。所有突触的相互作用发生在这里;胞体突触泯灭。

每个腹神经节（除了最后一个），每边有三个根。第一根包含支配腹足肌肉和感觉神经轴突的神经元轴突;第二根包含阶段性和补品伸肌的肌肉和感觉轴突轴突支配;，第三根，叶神经节神经线尾鳍几毫米，包含轴突innerv阿婷阶段性和补品屈肌肌肉。第三根有两个分支。深支（IIIA）支配屈肌肌肉只有阶段性的。每半段（IIIB）的第三根浅支包含六个轴突，它支配进补屈肌肌肉。

进补屈支配的神经元自发活跃，不同的是阶段性的传出神经元，并在一个很好的准备，他们将继续火多小时后，腹部已经从动物中删除。对于这些腹部的筹备工作所作的发现的历史性质的审查阿特伍德（2008）。四，运动神经元和周边抑制神经元支配半段在任何进补屈肌的胞体位于该段的神经节。余下的运动神经元的胞体位于在未来的尾椎节。这些神经元可能是可靠extracelluarly记录的尖峰振幅的基础上区别于对方。如果从一个半段的滋补屈肌与两个含有这种肌肉的神经元支配神经节中删除，五个神经元通常显示出某种程度的自发活动。这些神经元的编号相对外尖峰幅度的基础上，按升序排列。 F1到F4的运动神经元和F5，最大的自发活跃的神经元，是周边屈抑制剂。 F6，最大的运动神经元，是一个兴奋的运动神经元，这是很少自发地积极。

补虚运动神经元活动的自发性质，可通过外源性化合物的应用程序或运动神经活动正在监视一个在同一网段提供感官刺激角质层的调制。

2）解剖

要获得相同的步骤描述了上述检查外钾的静息膜电位的腹部伸准备。所不同的是采取照顾节段性神经束，沿一侧甲壳运行。这神经将被拉成吸电极作为刺激电极。在1 Hz刺激阶段性反应监测。 10至20的刺激，而刺激进补反应监测与短时间的脉冲10HZ。

照顾小龙虾进补屈肌肉的实验的实验过程是不同的，需要离开腹侧神经线完好无损。几个腹段组成，是一个准备。这是获得如下：

1. 应该得到一个小龙虾在车身长度约6-10厘米（或管理的大小）。获得控股的后脑勺，或约2或3厘米，从眼睛后面的小龙虾。确保小龙虾或口腔的爪子不能达到实验者在处理小龙虾。取出后丢弃的头部和附属物。
2. 使用剪刀，迅速取出头。做一个从落后的小龙虾眼睛的清洁和快速切割。
   
   图18。图像显示切的位置，以消除小龙虾的头部。
   在这一点上，以避免受伤的腿和小龙虾爪可以切除。男性和女性对男性和游泳的触控也可以被删除（图19和20）。接下来，从胸部腹部分开。设为削减沿关节膜，加入的腹部和胸部（图20）。
3. 小龙虾的腹部部分保存和处置的胸部。
   
   图19。图像上显示的小龙虾，可删除的口针的位置。
   
   图20。图像显示去除腹部胸部切的位置。
   
   图21。去除胸部，腹部。切割应在循环的方式，沿行段加入。
   
   图22。顶部图像显示与附属物的腹部。底部图像显示去除腹部附肢。
4. 放置在一个大培养皿中的盐溶液的孤立的尾巴准备。牵制的菜尾的上半部分的准备。确保编制是安全的。使用手术刀，删除的编制肋骨之间的腹侧方部分。
   
   图23。切应删除腹的准备药水的显示。
5. 应一小截（也可以用剪刀）。皮瓣应削减和取消向上。皮瓣，然后用剪刀除去，露出深屈肌的肌肉。在此过程中，应采用显微镜删除腹部分的准备，以确保精度。
   
   图24。切割用剪刀准备揭露肌肉。
   
   图25。图像显示皮瓣与钳抓。底部图像显示准备使用显微镜皮瓣去除。
   
   图26。曝光浅屈肌的肌肉。

3）细胞内记录：

图27。录音设备的总体格局。

1. 应与准备的培养皿放在显微镜下，在蜡盘，以防止运动的底部担保。
   
   图28显示的编制，在显微镜下的位置。用蜡，以确保在培养皿和准备。
2. 应获得两个短长银线的一端连接到电线。银线，应到少量的漂白剂浸泡20分钟左右，获得的Ag - CL涂层。使用前，用清水洗净线。一个细胞内的玻璃吸管，应得到认真填写，用氯化钾（3米）的解决方案。移液器应拒绝开放面临的地板和填补与解决方案。后者将确保，任何多余的氯化钾将电极的背面滴出。要确保没有氯化钾运行沿玻璃吸管将进入盐水浴。氯化钾溶液灌装完成时，打开移液器直立。银线，然后可以放入吸管。另一端是连接到“+”（正）极头舞台上。移液器，然后固定在电极针。应当作出不打破电极吸管。第三线连接到法拉第笼应放入绿色竿头阶段。最后剩余的铅银线应放置在洗澡时，另一端连接到 - （负）极图所示。电线也应放在从法拉第笼的AD转换器PowerLab系统的地面部分。头阶段是收购/放大器（PowerLab系统）连接到“输入探头”。
   
   图29头阶段配置。导线连接头阶段的绿色部分是接地的放大器或法拉第笼。红色部分连接线连接到电极丝。黑色部分是用来连接到沐浴解决方案。
   
   图30。“测试拨动”是在最后一行，测试电极电阻。 “粗”旋钮也发现下应把计数器的时钟明智的直流偏移。增益设置为50，信号放大系数五十。从头部阶段的接地线被放置在“GND”的针插孔开幕。
3. LabChart软件应打开台式机或笔记本上。调整图表显示只有一个通道，通过点击“设置”，然后选择“频道设置”。根据“频道设置”，更改号码渠道之一。点击“确定”。在图表的上方，左上角，每秒的周期应该是2K。设置伏特（Y轴）大约为200mV到500mV的。点击“通道1”就在屏幕的右手部分。点击“输入放大器。”确保差分框被选中。
   
   放大器的输出应在渠道之一。放大器应采用以下设置：
   
   • 高通直流
   • 陷波器关闭
   • 低通- 20KHZ
   • 逆时针容量比赛.-
   • 直流偏移的精细和课程旋钮逆时针
   • 直流偏置（关） - 关
   • 增益旋钮- 50
   • 输入（DIFF单声道GND） - 差速器
   • 模式（刺激栅极REC） - 拍摄
   • ΩTEST- OFF
4. 为了测量电极电阻，电压除以电流，这是2.0 nA的。结果值玻璃电极的电阻。电阻应20至60 MegaOhms。一旦阻力已经确定，细胞内的录音就可以开始。玻璃电极放置到盐水浴的提示。确保地线也是在盐水浴。
   要开始录制，按“开始”，在屏幕底部。确保在增益设置为5 V /格。使用放大器的当然旋钮移动LabChart零线，然后再插入电极。切换旋钮，应先关闭，然后关闭几次，以测试电极电阻。接下来，所产生的值的幅度应测量。放置一个制造商的稳定的底线，然后放置在高峰第二，获得的电极电阻。
5. 使用的电极探针和显微镜电极插入肌肉。不要穿透肌肉。使用显微镜和探头设置，以便找到一层薄薄的肌纤维和纤维电极插入。可用于高强度照明灯作为光源穿透肌肉时。
   
   图31。电极插入肌肉。
6. 必须小心，以避免损害神经根浅肌肉。
   明智的做法是保持冷却的筹备工作（10-15摄氏度），并同时开展的实验程序以及含氧盐水洗澡。如果冷却装置不可用生理盐水取代新鲜，冷却盐水定期。氧气，空气，或者至少应通过生理盐水冒泡。
7. 记录的自发活动的EPSPS。注意EPSPS的大小不同的，如果IPSPs存在。
8. 非常小心地取一小漆布什和沿在同一区段，一个是监测自发活动的角质层边用手刺激。注意改变反应的频率，如果出现不同大小的EPSPS，没有刺激角质层前。
   
   图32。制备与刺激的刷子和神经根。 （斯特朗等人，2000年修改）
9. 可反复刺激后，仔细地交换包含神经调节，如5 -羟色胺（1 _MICROM）或生理盐水与CO 2冒泡的盐水浴。请注意活动配置文件为一个给定的刺激效果。还要注意，如果交换生理盐水回新鲜生理盐水返回到其初始状态的活动。
10. 接下来，可以以各种方式监控感觉中枢神经系统运动神经元电路内的神经活动。我们可以用吸电极，而不是显示器的运动神经元活动的一个细胞内的电极（图33）。在玻璃吸电极尖端，塑料管放在它有一个开放的正确大小，拉入提示神经。开幕式不应过大，神经将下降;或过小，因为神经会损坏电极的压力。塑料管材拉过来的火焰和修剪到需要的大小。
    
    图33。设置吸电极记录的安排。
    定位在一个位置，吸电极容易获得的盐水浴显微。吸起来生理盐水，直到它与银线内吸电极接触。排列吸电极靠近电极尖端切端线，使两条电线将盐水浴接触。
    电气监控的AC / DC差分放大器（放大器）连接到电源实验室26T。通过适当的线连接，从输入PowerLab系统26T 1到放大器的输出。
    • 放大器的仪器控制应设置以下设置：
      • 高通直流
      • 陷波器关闭
      • 低通- 20KHZ
      • 逆时针容量比赛.-
      • 直流偏移的精细和课程旋钮逆时针
      • 直流偏置（关） - 关
      • 增益旋钮- 50
      • 输入（DIFF单声道GND） - 差速器
      • 模式（刺激栅极REC） - 拍摄
      • ΩTEST- OFF
    连接头阶段“输入探头放大器。
    自吸电极连接的电线头阶段。导线应连接在左上角的红色（阳性），在中间绿色（地），黑（负底部，这是表示在图34。地线可以在盐水浴。
    
    头阶段配置图34。
11. 现在笔记本电脑的USB线连接PowerLab系统26T。确保放大器和PowerLab26T插入并打开前开放的计算机上LabChart7。
12. 打开LabChart7。
    • LabChart欢迎中心中会弹出打开。关闭它。</ LI>
    • 点击安装程序
    • 点击通道设置。渠道的数量更改为1（盒左下角），按下OK。
    • 在图表的左上角设置每秒约2K的周期。伏特（Y轴）设置约500或200mV的。
    • 通道1上按一下右边的图表。点击输入放大器。确保设置：单端AC耦合，并反转（反转的信号，如果需要的话），抗混叠，检查。
    • 要开始录制按开始。
    我们可以记录从^第三根支配浅屈肌（分支的IIIb）监测与细胞外记录的动作电位的大小分支。外的神经冲动被称为“尖峰”。回想一下，有五个励磁运动神经元和抑制​​剂电机在这根神经元（1965年，肯尼迪和武田;贝莱斯和黄伟文，1978年）。用刷子或神经调曝光角质层的刺激，可以被利用（图35）。可以用画笔，手或一致的刺激，它可以安装在显微控制的压力和移动量。
    
    图35。 ^第三根在生理盐水（上）和100 nm的5 -羟色胺（底部）的表皮刺激之前和期间的活动。在角质层的刺激时表示酒吧。注意增强活动之前和之后的刺激时，准备沐浴在5 -羟色胺（斯特朗等人，2000年修改）。
    我们可以从^第一或^第二根记录EN顺便记录的神经;或者我们可以断面从VNC和创纪录的纯感官输入将发送信号到VNC的外围产生的根源。因此，您将记录从根切断通往感官活动的外围。
    ^第二根包含了非常大的主从肌肉受体的器官（MRO）和较小的轴突的传出神经伸肌运动神经元（字段和肯尼迪，1965年）传入轴突。有许多在^第一和^第二根感觉神经轴突。
    mechanosensory神经元有直接的连接，电突触与横向巨轴突（LG电子）（1969年克拉斯;朱克1972年）。此外，mechanosensory神经元激发interneurons通过化学突触。
    研究如何可以影响感觉输入，通过中枢神经系统的一种感官电机神经元电路运动神经元的活动，我们可以记录在肌肉的突触反应。可以检查电路的各个方面，我们将使用。例如，我们可以记录从感觉神经根单独或与或不完整的感官输入到VNC的分析尖峰频率录音电机根，可以计算一段时间内的时间在不同的条件。可采取的措施，之前刷的刺激，在一个给定的时间（图35）的刷刺激。一个可重复条件的5倍，并获得频率的平均水平作为衡量的变化作出比较。
    也可以适用于外源性化合物，如5 -羟色胺（斯特朗等，2000）或乙酰胆碱（Ach），尼古丁或谷氨酸。各种行为的行动已经对尼古丁的无脊椎动物。这表明尼古丁受体的存在（Tsunoyama和Gojobori，1998年）。谷氨酸是一个主要的大多数无脊椎动物在NMJ和乙酰胆碱的兴奋性神经递质是中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质（Monoghan等，1989;。沃特金斯，等，1990） 。
    人们可以尝试庚或CO ₂气泡生理盐水，因为它会解耦内电路博士索尼娅M. Bierbower（肯塔基大学）在她的博士论文研究显示纵隔（GAP）路口的小龙虾。这个动作可能会考虑改变整个动物的行为时，接触到环境中的高CO _{2（Bierbower}和库珀，2010）。当你刺激角质层，用刷子和驱动器的感觉输入，并记录在运动神经元的反应，如果有一个在活动前和期间_庚或CO 2曝光的区别。这可能会或可能不会建议缝隙连接，在感觉CNS电机神经元电路的作用。

膜电位

早在1902年，伯恩斯坦在乌贼轴突的静息电位的问题处理。这是耐人寻味的，要考虑如何将这些早期思想和Berstein（1902年）和能斯特（1888）的意见后在膜生理的影响研究。 （见Malmivuo和Plonsey，1995年的审查;在WWW上也可用 http://www.bem.fi/book/） 。还有，这一天，正在对离子通道的功能和属性是非常理解这涉及到组织，器官和系统功能的细胞生理学的重要的生物膜突破。

的实验和理论推导的外部效应的比较^[K +]静息膜电位表示离子的膜电位的影响。使用此相同的编制的其他实验，仍然要执行，以解决基本的生理问题。有些人早在1968年突出阿特伍德和帕纳斯还没有得到完全解决。在这次演习中获得的技术，可以继续回答其余的许多问题在其他实验的准备工作以及在相关的医学和健康的生理应用。我们已经展示了一个模型的无脊椎动物准备解决的根本问题有关的所有动物的实用性。

就在这上面的练习中的离子的电化学梯度获得的知识，你现在可以提前膜的兴奋性突触传递的研究在小龙虾的神经肌肉准备。

测量突触反应

这个实验室的第一部分，以及相关的影片提供的细节，都提供了记录膜电位，调查肌肉结构的关键步骤。在本实验室的第二部分，解剖和阶段性和补品电机单位NMJs记录突触传递的示范提供了一个暴露在生理学的基本概念。一个神经回路，它可以在部分可以用来解释相关的行为，在完整的动物，有潜力，不仅为学生，调查他们的实验室内行使各种开放式问题，也为未来的研究神经回路在一个良好的曝光建立无脊椎动物的准备（Kennedy 等，1969; Antonsen和爱德华兹，2003）

这些准备工作也可以用于研究突触的便利，抑郁症和长期可塑性（而不是在本实验室研究调查）。 ，即使是在小龙虾一些物种，取决于神经可塑性的实验刺激条件（Mercier和阿特伍德，1989年Cooper 等人，1998年）以及他们的自然环境。在何种程度上改变突触效能和肌肉动态服务能力的动物还有待调查。由于小龙虾不改变其季节变化和蜕皮周期中的行为，也有相对长期在他们的神经肌肉系统的活动的分歧。它已被证明阶段性电机爪接近肌肉的神经末梢在冬季表现出经典的阶段性形态，但膨胀，并成为更多静脉曲张在暑假期间（Lnenicka 1993年; Lnenicka，赵，1991）沿码头的长度。

在小龙虾横向巨头（LG）的interneurons腹神经索内进行一些早期的研究表明，存在的差距路口（1924年生，1961年）;渡边Grundfest，。这是人所共知的CO ₂有电气通信偶联缝隙连接（阿雷利亚诺等，1990）的影响。这是最近出现的神经线，并在本报告所述，在感觉CNS电机肌肉电路的通信也很敏感_，CO 2曝光，表明存在的差距路口（Bierbower 2010年; Bierbower和库珀， 2010）

3 ^路电机根已自发活动的主题，因为1960年的时，埃克特（1961年）研究如果进补射击静态肌肉受体的器官（MRO）在相同或邻近的段占自发电机驱动。在这些早期的研究中，很明显，这项活动是在腹神经索（VNC）的驱动可能从较高的中心（埃克特，1961年，肯尼迪和武田，1965a，B;斯特朗等， 2000）。由于存在的CO ₂停止自发的活动，可以假设驱动器中的运动神经元，可能有差距路口或谷氨酸的兴奋驱动。 NMJs是阻止或表现出的敏感性降低谷氨酸的CO ₂的存在，以及他们可能会集团中枢神经系统内以及KED（Bierbower，2010; Bierbower和Cooper，2010;也见Badre 等人，2005年）。

各种神经调的动作也很容易在NMJs（Cooper和Cooper，2009; Griffis等，2000; Southard等，2000;。斯特朗等，2000）的各类研究。此外，施加各种影响中枢神经系统的电路上的神经调。有人曾建议的5 -羟色胺和octopaminergic神经元可能会改变神经回路的输出（ 马等，1992;。施耐德等，1996;霍纳等，1997年为“增益制定”功能;爱德华兹 。 等，2002）。之前，我们完全可以理解的个别靶细胞的神经调的影响，还有许多工作有待完成。由于不同的神经调质可能与另一个演唱会的工作，分析其混合行动是为未来的研究（Djokaj等。2001）领域。此外，研究较少，特别是在脊椎动物，解决整个通路的神经调质，它可以调节的具体行为的影响。在这种感觉CNS电机单位编制，可以检查的感觉输入和上运动神经元（Kennedy等，1969）活动的神经调质的影响。

既然已经推测，5 -羟色胺起着一定的作用，在规范国家行为的小龙虾，龙虾，螃蟹（利文斯通等，1980; Sneddon 的等，2000），作了一些尝试，以确定其浓度VNC的，血淋巴中分离出神经节龙虾（利文斯通等人 ，1980年;哈里斯瓦里克和Kravitz的1984年; Fadool 等 ，1988）。然而，有相当大的变化，在记录的测量，排除特定的剂量 - 反应关系，这可以解释为行为的行动。

一直被认为与中提出的立场和下腹部卷起的尾巴举行的爪小龙虾，表现出主宰的姿态（ 利文斯通等，1980 ）。小龙虾腹部屈曲状态，不会出现的架势，占主导地位的小龙虾，在一对，展览期间的社会互动，或同时保持一个占主导地位的等级地位（ Listerman等，2000）。唯唯诺诺的小龙虾，甚至会掖下自己的肚子，因为他们从对手撤退。这种尾巴每天进食也被看作是一个防御姿态（Listerman 等，2000）。这些行为已经很容易观察到的在野外和实验室设置（Bovbjerg，1953年，1956年; Bruski和邓纳姆，1987年，李等，2000;。Listerman等 ，2000）。有趣的是，行为的姿势，在龙虾（ 利文斯通等 ，1980）指出，扭转了5 -羟色胺和章鱼胺注射在澳洲龙虾 ，Cherax析构函数（麦克雷，1996年）。可能，完全不同的反应，将观察到浅屈肌准备在澳洲小龙虾。此外，因为优势是一般大小之间的小龙虾相关，期望塑料响应系统为迅速改变的社会条件（ 斯特朗等人，2000年） 。在无脊椎动物的神经调质可塑性响应是一个开放的调查面积。

Wyttenbach，Johnson和霍伊（1999年）已经产生了数字媒体实验室手册和涉及相同的肌肉在本报告除了其他小龙虾准备提交的各种小龙虾experimentations。这是一个优秀的资源为学生练习。

没有利益冲突的声明。

肯塔基大学生物系，本科课程和艺术与科学学院办公室支持。

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