生理实验与小龙虾肠：学生实验室的工作

Cooper, A. S., Leksrisawat, B., Gilberts, A. B., Mercier, A. J., Cooper, R. L. Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise. J. Vis. Exp. (47), e2324, doi:10.3791/2324 (2011).

该报告的目的是描述准备的小龙虾肠的解剖技术，并演示如何使一个力传感器的生理录音监控收缩的力量。此外，我们演示了如何在视觉监控蠕动的活性，可作为各种肽的生物活性，生物胺神经递质。这种准备是适合学生在生理和药理概念展示给学生实验室。这个准备工作已经在使用了100多年，它仍然提供了作为一个负责调查的蠕动节奏的产生和调节，并描述的内在机制，其调制的模型。药理实验和受体的分型，50年前开始对肠仍然有助于今天的研究。这个强大的准备非常适合于训练学生在生理学和药理学。

1。简介

最近期的小龙虾肠进行全面的概述，遵守在论文中，由芭芭拉博士E. Musolf“（2007年，美国佐治亚州亚特兰大，佐治亚州立大学，），主要集中在-羟色胺的调制和支配（Musolf等人，2009 ）。甲壳类hindguts首先研究了100年前Alexandrowicz，在比较解剖学的先驱（Alexandrowicz 1909年），描述了他们的神经支配的各个方面。继续研究多年来，确定肌肉层和结构类型，解决的整体功能，在整个动物渗透调节肠和各种化合物的研究肠收缩的调节控制（见审查，2007年由Musolf）。有趣的是，要注意肛门的后肠部分的行为不仅要排出粪便，但也采取了从水的渗透调节环境。这个地区的肠道可以进行向前或逆蠕动，根据动物的需求。

Alexandrowicz（1909年）确定的两个神经丛，支配的甲壳类动物的肠，一种内在的神经和外丛，后来被证明是用于识别和表征神经递质的丰富来源。在1950年的博士恩斯特弗洛里开始了一系列小龙虾肠药理研究表明收缩是由乙酰胆碱及其相关化合物，并通过肾上腺素和去甲肾上腺素（弗洛里，1954年）调制。弗洛里，被称为抑制性物质的发现者“因子- I”，研究这种物质上的各项准备工作，包括在小龙虾的胃肠道系统（弗洛里，1961年）的影响。因子- I后来被证明是GABA的。因此，小龙虾肠突触抑制的早期研究中发挥重要作用。

发现的GABA之后，其他公认的发射机也显示肠丛引起的生理反应。这种发射器，包括多巴胺（Elekes 等 1988年; Elofsson 等1968年），proctolin（RYLPG - OH;名士等 1997年）两个orcokinin肽（NFDEIDRSGFGFN和AFDEIDRSGFGFN; Bungart 等1994;。Dircksen等 2000） ，orcomyotropin（FDAFTTGFamide; Dircksen 等 2000）和一个myosuppressin肽（名士等1997;。最有可能的pQDLDHVFLRFamide，比照Stemmler 等 2007年）。这些物质中的每个调节自发性肠收缩，除GABA的似乎是兴奋。肠也响应谷氨酸和quisqualate（琼斯，1962;错误等，2003），但谷氨酸能神经支配的明确证据尚未见报道。细胞内信使，调解各种变送器的影响主要是未开发的，但有证据表明多巴胺的能力，以加强宫缩（Knotz名士，1995年）中cAMP参与。

虽然甲壳类动物的肠合同自发去神经后，这种收缩是典型的薄弱和混乱（威尔士，1982年; Winlow Laverack，1972a）。蠕动运动，需要协调的中枢神经系统的电机的输出，显然在过去的腹神经节（Winlow＆Laverack，1972a，B，C）始发。小龙虾，电机的输出进行肠通过的^第 7 ^次腹部根，其中包含75轴突，其胞体在过去的腹神经节（Kondoh久田荣，1986年）的本地化。至少出现一些肽肠神经丛神经元在过去的腹神经节（Dircksen等人2000年，名士等1991b; Siwicki主教，1986年）的提供，但多巴胺是提供更多的神经元前神经节（名士等。1991a）。由于电机输出通过的^第 7 ^次腹部根大，协调的收缩是必要的，它很可能部分或所有上面列出的假定发射机蠕动的方式在一些贡献。然而，他们的相对贡献尚不清楚。由圆形和纵肌（名士与李，2002），学习他们的影响，可能获得一些有识之士。

除了控制未消化食物的运动，与甲壳类动物肠相关的神经丛，似乎发挥了重要的内分泌功能与蜕皮有关。蟹肠，Carcinus maenas，包含内分泌细胞释放甲壳动物高血糖激素和其相关的前体肽在蜕皮（ 韦伯斯特等人，2000），建议在吸水作用和肿胀与蜕皮。因此，甲壳类动物的肠参与了几个重要的生理过程。

这份报告主要是为先进的高中和本科学生在生理学课程，在实验中参与的教学工具。的意义，以及背后的肠合同和功能可以由学生解决的潜在机制。将用于药理剂，神经递质和神经激素，剂量反应曲线，将兴建，这将从事学生如何获取和解释的生理和药理数据。一个一般的理解受体激动剂和拮抗剂方面的功能也可以实现。学生还将学习目前在图形化的形式进行统计分析的数据。

这是很容易的解剖和记录小龙虾肠收缩。在解剖的准备，肠道中很容易暴露于外源性物质。蠕动活动的改变，可以监视目视或用一个力传感器，还可以监视的收缩力。由于它的简单性和可靠性作为生物活性制剂，小龙虾肠仍然是调查有关调制电机输出和肌肉的收缩，蠕动，及受体功能的机制的许多研究问题非常有用。后肠也可用于测试杀虫剂，crustaceancides，并为具体的行动机制的污染物。

2。方法

2.1）材料

• 小龙虾
• 小龙虾生理盐水
• 清扫仪器（粗精剪刀，粗与细的镊子）
• Sylgard平底培养皿
• 钢解剖引脚
• 烧杯（持有化学解决方案）
• 封口膜（覆盖和混合解决方案）

2.2）夹层

1. 龙虾（ 克氏螯虾 ）测量体长6-10厘米，应在冰上放置5至10分钟，麻醉开始前清扫动物。
2. 从后面的爪子，用一只手握住麻醉的小龙虾。很快，削减从眼窝中间的头两侧，然后斩首小龙虾（注：从筹备的血液会被粘当它变干，所以洗的工具时完成）。
   
   图1：小龙虾斩首
3. 切断螯和腿走路。
4. 切断左，右的尾翼，只留下中间的尾鳍（uropod）。
5. 在背侧的小龙虾腹部切背角质层的左侧和右侧。
   
   图2：背角质层去除
6. 横向剪切背侧的角质层，确保切割浅，以防止损害胃肠，然后取出背腹角质层下段。
7. 解剖小龙虾放入一个Sylgard内衬的菜。
8. 垂尾尖端脚的小龙虾的菜。有人可能会使用更多的引脚上胃肠两侧必要的身体。
9. 小龙虾生理盐水填充盘覆盖胃肠确保不断扑灭胃肠使用吸管生理盐水。生理盐水的修改后的范Harreveld解决方案（1936年），这是用205毫米氯化钠，5.3毫米氯化钾_，氯化钙_{2 ·} 2H 2 O 13.5毫米，2.45 _毫米氯化镁_{2 ·} 6H 2 O 5毫米的HEPES和调整pH至7.4。解剖小龙虾应该会出现如图3所示。
   
   图3：解剖与GI完整的小龙虾。

2.3）实验

在动物2.3.1）宫缩

1. 有解决方案的化合物进行测试准备和在相同的温度洗澡盐水。可能使用的个性化解决方案的5 - 羟色胺（100纳米，1microM），谷氨酸（1microM），和小龙虾生理盐水开始进行测试的物质多巴胺（1microM）。
2. 允许解剖坐了大约10分钟的小龙虾，以小龙虾的解决方案，使其能够调整夹层和盐水接触的冲击。从肠缓慢蠕动收缩，开始出现。
3. 一旦宫缩开始，记录收缩30秒（注意收缩，发生的类型：即蠕动类型，或痉挛，任何蠕动波方向）发生的数量。
   表1：小龙虾盐水收缩
   

   收缩的数目	宫缩类型

4. 使用一个PIpette内拆除的小龙虾的腹部暴露腔，生理盐水，并应用生理盐水包含的实质内容进行审查直接到肠。
5. 后立即加入该解决方案中，创纪录的30秒后发生的收缩，并注意发生的收缩（即蠕动，或痉挛）的类型。
   表2：与接触的化合物的收缩
   

   复合测试	集中	收缩的数目	宫缩类型

6. 记录测试物质的反应后，立即与正常的小龙虾生理盐水冲洗胃肠几次。让我们站在5分钟的准备，而约每30秒小龙虾生理盐水漂洗。
7. 使用移液器，将一些包含在未来的化合物进行检查，或直接到肠测试的最后物质的不同浓度的盐水。最好是先用较低的浓度和工作之一的浓度较高。
8. 后立即加入每一个新的物质或每一个新的浓度，记录的30秒后发生的收缩，并注意宫缩的类型。

2.3.2）记录在切除的准备收缩力量

图4：安装程序

1. 将传感器的桥梁POD。
2. PowerLab系统26T连接的桥梁POD。
3. PowerLab系统26T连接到计算机上的U​​SB端口。
4. LabChart7打开，通过点击labchart7桌面上的图标。
   • LabChart欢迎中心中会弹出打开。关闭它。
   • 点击安装程序
   • 点击通道设置。渠道的数量更改为1（盒左下角），按下OK。
   • 在图表的左上角设置每秒约2K的周期。设置伏特（Y轴），约500或200毫伏。
   • 通道1上按一下右边的图表。点击输入放大器。确保设置：单端AC耦合，并反转（反转的信号，如果需要的话），抗混叠，检查。
   • 要开始录制按开始。
5. 拿起准备和减少胃肠道之间的胸部和腹部的时刻。然后小心地切断周围的尾部的尾节的一部分。删除从消化道解剖小龙虾放入Sylgard菜。有一个血管，沿背消化道方面运行。小心地拉出远离消化道。倒到准备新鲜的小龙虾生理盐水。
6. 放置在附近的解剖小龙虾钳力传感器。
7. 钩在小龙虾胃肠道的力传感器，如图5所示。
   
   图5：钩力传感器连接到孤立的肠生理盐水中的小龙虾
8. 等待，直到胃肠开始收缩，并推开始的LabChart7。
9. 让程序运行约20秒。按下“停止”，并添加注释标记，“吊只”。填写表4。
   表四：化合物收缩
   

   收缩的数目	收缩幅度（MV）

10. 添加感兴趣的测试化合物，并立即按下“开始”上LabChart7“。
11. 让程序运行约20秒。按下“停止”，并添加评论，直接添加了什么物质，其浓度的图表文件。请填写下面的表格。
    表5：_________复合收缩
    

    收缩的数目	收缩幅度（MV）

12. 使用吸管的小龙虾生理盐水冲洗掉的准备。
13. 添加其他物质或不同浓度，以类似的方式。立即按下“开始”上LabChart7。
14. 让程序运行约20秒。按下“停止”，并直接在图表上文件中添加一条注释和标签，说明在Compound使用和浓度。

3。数据分析

1. 从2.3.1的实验，图中的每个溶液（生理盐水，血清素，谷氨酸）随时间的收缩。说明任何趋势。
2. 从2.3.2实验，图中的每个解决方案的收缩的数量（生理盐水，血清素，谷氨酸） - 在mV的收缩幅度。说明任何趋势。

3.1）测量的收缩速度和力量

索引上的收缩率可以衡量的时间，从开始一个偏转未来的开始或数超过一两分钟的总挠度。的值，然后可以在每分钟或每秒取决于他们正在迅速发生收缩。

索引收缩力的一个相对值可以用来比较不同的条件。所保存的文件，可以使用的“M”标志和移动基线。然后使用光标移动到峰值的偏转，并注意屏幕右上角列为一个delta值（从M的差异，以峰）值。请注意光标需要保持固定为衡量的变化。然后移动的M下一波形式的利益和重复测量。

在相关的电影和文字所提供的细节描 ​​述所需的关键步骤，在小龙虾的肠活动记录在原位，以及在体外。我们报告的目标之一是增加的意识，在学生跑教生理学和药理学的基本概念的调查实验室，该制剂的潜力。

这些准备工作，可用于研究实验的问题，这将导致更好地了解了肠生理功能。蠕动波及其逆转的调控的内在机制仍然不知道。较高的控制整个消化道的机制还没有完全理解。较高的中心是如何整合他们的活动与自主输出，直接控制胃肠道系统的问题仍然是一个开放的调查面积（Shuranova等，2006） 。此外，渗透调节能力的甲壳动物的肠和蜕皮和环境压力的过程中渗透调节功能没有得到充分的阐述。还有许多问题等待在这准备的答案。

没有利益冲突的声明。

肯塔基大学生物系，本科课程和艺术与科学学院办公室支持。

1. Alexandrowicz, J. S. Zur Kenntnis des sympathischen Nervensystems der Crustaceae. Jena Z. Naturw. 45, 395-444 (1909).
2. Bungart, D., Dircksen, H. & Keller, R. Quantitative determination and distribution of the myotropic neuropeptide orcokinin in the nervous system of astacidean crustaceans. Peptides 15, 393-400 (1994).
3. Dircksen, H., Burdzik, S., Sauter, A. & Keller, R. Two orcokinins and the novel octapeptide orcomyotropin in the hindgut of the crayfish Orconectes limosus: identified myostimulatory neuropeptides originating totether in neurons of the terminal abdominal ganglion. J. Exp. Biol. 203, 2807-2818 (2000).
4. Elekes, K., Florey, E., Cahil, M.A., Hoeger, U. & Geffard, M. Morphology, synaptic connections and neurotransmitters of the efferent neurons of the crayfish hindgut. In: Salanki J, Rosza K (eds) Neurobiology of Invertebrates, Vol. 36, Akademiai Kiado, Budapest, pp 129-146 (1988).
5. Elofsson, R., Kauri, T., Nielsen, S.O. & Stroemberg, J.O. Catecholamine-containing nerve fibres in the hindgut of the crayfish Astacus astacus L. Experentia 24, 1159-1160 (1968).
6. Florey, E. Uber die wirkung von acetylcholin, adrenalin, nor-adrenalin, faktor I und anderen substanzen auf den isolierten enddarm des flusskrebses Cambarus clarkii Girard. Z. Vergl. Physiol. 36, 1-8 (1954).
7. Florey, E. A new test preparation for bio-assay of Factor I and gamma-aminobutyric acid. J. Physiol. 156, 1-7 (1961).
8. Jones, H.C. The action of L-glutamic acid and of structurally related compounds on the hind gut of the crayfish. J. Physiol. (London) 164, 295-300 (1962).
9. Knotz, S. & Mercier, A.J. cAMP mediates dopamine-evoked hindgut contractions in the crayfish, Procambarus clarkii. Comp. Biochem. Physiol.111A, 59-64 (1995).
10. Kondoh, Y. & Hisada, M. Neuroanatomy of the terminal (sixth abdominal) ganglion of the crayfish, Procambarus clarkii (Girard). Cell. Tiss. Res. 243, 273-288 (1986).
11. Mercier, A.J., Lange, A.B., TeBrugge, V. & Orchard, I. Evidence for proctolin-like and FMRFamide-like neuropeptides associated with the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii Can. J. Zool. 75, 1208-1225 (1997).
12. Mercier, A.J. & Lee, J. Differential effects of neuropeptides on circular and longitudinal muscles of the crayfish hindgut. Peptides 23, 1751-1757 (2002).
13. Mercier, A.J., Orchard, I. & Schmoeckel, A. Catecholaminergic neurons supplying the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii. Can. J. Zool. 69, 2778-2785 (1991a).
14. Mercier, A.J., Orchard, I. & TeBrugge, V. FMRFamide-like immunoreactivity in the crayfish nervous system. J. exp. Biol. 156, 519-538 (1991b).
15. Mercier, A.J., Orchard, I., TeBrugge, V & Skerrett, M. Isolation of two FMRFamide-related peptides from crayfish pericardial organs. Peptides 14, 137-143 (1993).
16. Musolf, B.E. Serotonergic modulation of the crayfish hindgut: Effects on hindgut contractility and regulation of serotonin on hindgut. Dissertation (2007). (Downloaded from an open access source at Georgia State University; http://etd.gsu.edu/theses/available/etd-11272007-175638/ )
17. Musolf, B.E., Spitzer, N., Antonsen, B.L. & Edwards, D.H. Serotonergic modulation of crayfish hindgut. Biol Bull. 217(1), 50-64 (2009).
18. Shuranova, Z.P., Burmistrov, Y.M., & Cooper, R.L. A hundred years ago and now: A short essay on the study of the crustacean hindgut. (Vor hundert Jahren und nun: Eine kurze Geschichte von die Forschung des Hinterdarmes der Crustaceen). Crustaceana 76, 755-670 (2003).
19. Shuranova, Z.P., Burmistrov, Y.M., Strawn, J.R. & Cooper, R.L. Evidence for an Autonomic Nervous System in Decapod Crustaceans. International Journal of Zoological Research 2(3), 242-283 (2006).
20. Siwicki, K.K. & Bishop, C.A. Mapping of proctolinlike immunoreactivity in the nervsou systems of lobster and crayfish. J. comp. Neurol. 243, 435-453 (1986).
21. Stemmler, E.A., Cashman, C.R., Messinger, D.I., Gardner, N.P., Dickinson, P.S. & Christie, A.D. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides 28, 2104-2115 (2007).
22. Wales, W. Control of mouthparts and gut. In: The Biology of Crustacea, Vol. 4; D.C. Sandeman and H.L. Atwood, eds.; Academic Press Inc., London; pp. 165-191 (1982).
23. Webster, S.G., Dircksen, H. & Chung, J.S. Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide. J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).
24. Winlow, W. & Laverack, M.S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity. Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972a).
25. Winlow, W. & Laverack, M.S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output. Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972b)
.
26. Winlow, W. & Laverack, M.S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies. Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972c).
27. Wrong, A.D., Sammahin, M., Richardson, R. & Mercier, A.J. Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut. J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).

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