のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

I.遺伝クロッシング

1。女性の親をEmasculating

DNA配列の多型を使用して母親と父親の対立遺伝子を区別するために、二つの異なる生態型、例えば、コロンビア- 0（COL - 0）とLERは、女性と男性の両親として選択されます。植物は、若くて健康でなければなりません。一つは、解剖顕微鏡、拡大鏡のバイザー、または肉眼を使用して女性の親を骨抜きにすることができます。ステージ- 12花を見つけて（スミスら 、1990）とハサミと小花柄のベースクリッピングによるあらゆる花やsiliques上下それらを削除します。鉗子上の任意の花粉を除去し、同様に花粉を殺す95％エタノール、のビーカーに静かに先端の基盤を浸漬することで鉗子を滅菌する。静かに鉗子を使用して花芽をこじ開ける、ゆっくりと雌しべがむき出しとそのままにして、4がく片、4枚の花弁、6雄しべを取り除く。このプロセスの間に心皮への損傷を避けるようにしてください。

2。花粉ドナーをピッキングし、受粉を行っ

最高の花粉のドナーは、花粉の多くが脱落している雌ずい（スミスら 、1990）、90 °の角度で伸びる花びらでステージ14で開いている花をanthesedされています。ベースで花をつかむと、ちょうど小花柄の上に、これは花が開いて広がることになります。葯と準備雌しべの柱頭ほこりを取り除きます。受粉後、汚名は簡単に顕微鏡下で観察することができる黄色の花粉で覆われる。

3。クロスのラベリング

植物のすべての去勢雌しべを受粉した後、我々は、宝石のタグと、女性と男性の両親と日付の情報をクロスにラベルを付けます。工場に近い土壌​​の株式を置く、株式への花序の茎を結ぶために文字列を使用して、ビニール袋で受粉雌しべをカバー。

II。 シロイヌナズナにおける胚乳組織の分離

1。材料の準備

液体窒素タンク、液体窒素、解剖顕微鏡、精密チップピンセット（デュモン生物学、スイスで5 INOX FST）、顕微鏡のスライドガラス（の二つの新しいペア：我々は通常、胚乳および胚組織を収穫する前に準備が必要な材料を得る3"X 1"X 1.0 mm）を、ソルビトール0.3 MのpH 5.7溶液及び5mMのMES。

2。収集siliques

7時 - または8日目の後の受粉（DAP）、種子は胚発生の後期魚雷段階半ばまでに収穫し、胚乳および胚のために解剖する準備が整いました。去勢花は若すぎる場合、時に、それは9〜10 DAPがかかる場合があります。

3。胚乳および胚の隔離

シロイヌナズナの種子は小さいですので、我々は、胚乳および胚を分離するために解剖顕微鏡を使用してください。顕微鏡下で8 DAPの​​長角果を入れ、長角果柄を保持するためにピンセットを使って二心皮のヒューズマージンで開いて長角果をスライドさせて鉗子の別のペアの先端を使用してください。種皮から胚乳と別の胚乳を押し出すためにカットされていない端を絞る、胚を引き出すために卵門端に小さなカットを行う、ソルビトール0.3 Mおよび5mM MESのpHは5.7ソリューションにつのシードをピックアップしてピンセットを使用して、 （木下ら 、2004）。液体窒素で別々のマイクロチューブに胚と胚乳を置く。 -80℃の冷凍庫に管を保管し、我々は10〜15 siliquesから胚や胚乳を蓄積するまで、これを続けると。いくつかのケースでは、胚乳は種皮、すなわちから分離する必要がない、人は遺伝子刷り込みの分析のための胚乳と種子コートの混合物からトータルRNAを分離することができます。

III。バイサルファイトシークエンシング

1。必要な試薬

、：ゲノムDNA、制限酵素、3 M水酸化ナトリウム（たて）、6.42 Mの尿素/ 4 Mの亜硫酸水素ナトリウム（190 2 Mのメタ重亜硫酸ナトリウム、Sigma - Aldrichは、S9000、Na2S2O5、分子量）を調製するためのセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB） 10mMのヒドロキノン、DNA精製キット（Promega社ウィザードDNAクリーンアップシステム、カタログ番号A7280）、TEバッファー、6.3 M水酸化ナトリウム（たて）、10 M NH ₄ OAC、20μg/μLのtRNAは、100％エタノール。

2。亜硫酸水素塩の治療プロトコルの詳細

1. CTABの手順を（ロジャーズとBendich、1988）を用いたゲノム胚乳や胚のDNAを分離します。
2. ダイジェストは100 ng - 分析する領域の外側に切断する制限酵素で100μL全量を20μLのゲノムDNA2μgの。 MEAのプロモーターの場合は、我々はXhoIで、NdeIで、とPstIまたはHindIII部位を使用してください。
3. 5分間DNAを煮沸して制限酵素を変性し、氷上で急冷する。
4. 15分間37℃で3 M NaOHおよびインキュベートの1 / 9量（20μL消化されたDNA 2.2μL）° Cを追加。
5. 250μLのPCRチューブにソリューションを転送する。
6. 滅菌蒸留水10mlに尿素7.5 gを溶かし、ゆっくりと1〜2時間にわたってメタ重亜硫酸ナトリウムの7.6 gを追加し、加熱は、通常、溶解することができます。焼きたての10 M NaOHで5にpHを調整し、最終的に滅菌蒸留水を追加します。 20mlに容積。これは、6.24 Mの尿素/ 4 Mの亜硫酸水素ナトリウムのソリューションです。
7. それぞれ、5.36 Mおよび3.44 Mの最終濃度に6.24 Mの尿素/ 4 Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液を加える（ポーリンら 、1998）。例えば、変性したゲノムDNAの上に22.2μL（小ら 、2003）に6.42 Mの尿素/ 4 Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液を208μLを加える。
8. 0.5mMの（20μL消化は12μL）の最終濃度でDNAを10 mMヒドロキノンを追加。
9. 55 30サイクル℃で15分間と30秒間95 ° C：PCRのマシンで亜硫酸水素塩処理を行う。
10. プロメガからウィザードのDNAクリーンアップシステムを用いてBisulfite処理したDNAを脱塩し、（ヤコブセンら 、2000）プロトコルをフォローアップ。
11. 脱塩後にカラムから回収TEの正確な体積を測定し、37℃0.3 Mインキュベートの最終濃度は6.3 M NaOHを加える℃で15分間。
12. 3 Mの最終濃度10 M NH ₄ OAC液（pH7.0）、20μg/μLのtRNAの2μL、および100％エタノールとしてミックスの3倍量を追加。 14,000 rpmで15分間遠心。
13. 、70％エタノールで1回ペレットを洗浄短い遠心を行い、余分なエタノールを除去します。
14. 25の5-10分を再懸濁します用speedvacのドライペレット - DNAの量を始めるに応じて、100μlのTEバッファー。ナトリウム、亜硫酸水素塩処理したDNAは、現在のPCR解析の準備ができています。

3。 PCRの増幅

1. 非メチル化シトシンをウラシルに変換されるので、テンプレートとして、亜硫酸水素塩処理したDNAを用いて大規模な断片を増幅することは困難です。従って、我々は通常500 bpよりもはや製品を増幅するプライマーを設計する。シーケンス4 KB MEAのプロモーターをするために、我々は、プライマーの多くのセットを設計し、14重複したフラグメントは、地域全体をカバーするために増幅（小ら 、2003）。
2. シーケンスに上部の鎖は、フォワードプライマー、I）の設計でプライマー内に追加可能なエキストラ長いヌクレオチドことなく、より高いアニーリング温度を持つために、G（グアニン）に富んだ領域を選択し、II）の変更C（シトシン）Yへ（ CGとCNGコンテキストにおけるピリミジン）とT（チミン）に、残りのCを変更してください。リバースプライマーを設計する上で、I）C -リッチ領域を選択する、II）は、CGでのR（プリン）とCNGコンテキストにGを変更し、A（アデニン）に残りのGに変更。
3. フォワードプライマーを設計する上でシーケンスボトムストランドを、、私に）C -リッチ領域を選択する、II）は、CGでのRおよびCNGコンテキストにGを変更し、リバースプライマー、私の設計ではAに、残りのGを変更） G -リッチ領域、II）CGでのYのC（ピリミジン）とCNGコンテキストを変更し、T.、残りのCを変更する
4. 我々は通常、各PCR増幅（小ら 、2003）のためのテンプレートとしてナトリウム、亜硫酸水素塩処理したDNAの1〜2μLを使用してください。 PCR産物は、ゲルインサートとして精製し、TOPO TAクローニングベクターpCR2.1（Invitrogen）にクローニングすることに、フラグメントの正しいサイズを確認するために、ゲル電気泳動によって分析する必要があります。単一のコロニーを拾い、培養され、プラスミドDNAを抽出し、配列決定のために送信されます。

4。シーケンスの解析

バイサルファイトシークエンシングの原理は、非メチル化シトシンがPCR産物にチミンとして増幅されるpH5.0での亜硫酸水素ナトリウムの高濃度で加水分解的脱アミノによるウラシルに変換されますです、5 - メチルシトシンは亜硫酸水素ナトリウムによって変更されることはありませんが、とPCR増幅後のシトシンに残ります（。クラークら 、1994;海外ホテルら、1992。）。シーケンシングの結果を得た後、我々は、PCR増幅に使用される鎖特異的なテンプレートと比較します。テンプレート内のシトシン残基は配列決定の結果でチミンとして読み取る場合、それはシトシンがメチル化されていないことを示しています。テンプレート内のシトシン残基はシーケンス中のシトシンのままである場合、それはシトシンがメチル化されていることを意味します。

IV。代表的な結果

図1。

それは、胚乳と種皮から胚を分離することは比較的容易ですが、それは胚発生の初期または中期魚雷の段階で、特に種子のために、種皮から胚乳を分離することは面倒です。種皮のみを組織のごく少量を寄与するため、いくつかの遺伝子については、例えば、MEAとFWAは 、我々は種皮から胚乳を分離する必要はありません。我々は胚乳と種皮の組織の混合物からRNAを分離できることを意味、遺伝子の母親と父親の対立遺伝子の発現を確認し、胚における発現と比較して、遺伝子の刷り込みの状態を決定する。

バイサルファイトシークエンシングのために、設計されたプライマーは、鎖特異的である必要があります。時には、それは、亜硫酸水素ナトリウム処理による損傷DNAのテンプレートのために、亜硫酸水素塩処理したゲノムDNAから断片を増幅することは困難であり、我々は通常、様々な地域や短い断片でPCRプライマーの異なるセットを試してみてください。制限酵素消化後、ゲノムDNAは、亜硫酸水素の脱アミノ化は、ほとんど二本鎖DNA構造のシトシン残基上では動作しないので、一本鎖に完全に変性する必要があります。別のキーには、亜硫酸水素塩処理が完了する必要があることです。既知の非メチル化シトシンを、亜硫酸水素塩シークエンス中のチミンに変換されていない場合、それは亜硫酸水素塩処理が適切に実施されていないことを示します。未知の地域の多くのシトシン残基は、重亜硫酸塩シークエンシングでチミンに変更されていない場合、あるいは、、それが原因で未変換DNAではなく、地域のすべてのメチル化シトシン残基の表示の増幅する可能性があります。

実験が正しく行われている場合亜硫酸水素ナトリウムの塩基配列決定は、正確に特定のシトシン残基は、ゲノムにメチル化されているかどうかを明らかにすることができます（ヘンダーソンら 、2010）。 。謝ら 、そのようなイルミナGenome Analyzerのハイスループットシーケンシングプラットフォームとして、最近のハイスループットシーケンシング技術、とシーケンシング亜硫酸水素ナトリウムを組み合わせることで、人は植物や哺乳類における一塩基の解像度（Cokus ら 、2008年エピゲノムをマッピングすることができます。、2009;リスターら、2008;。リスターら、2009）。。