Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

1) Обогащение мужского населения

1. В зависимости от экспериментальной необходимо большое число мужчин может быть получена путем использования одного из следующих стратегий:
   1. большой популяции диких мужчин типа может быть получен путем скрещивания дикой 5 мужчин и 1 типа гермафродит на небольшой лужайке OP50 посеян в центре пластины NGM. Примерно 50% последующее поколение будет диких мужчин типа.
   2. его-5 (e1490), либо его-8 (e1489) гермафродиты выбросить большое количество мужчин. ним-5 и его-8 самцов плодородная и нет очевидных дефектов в морфологии сперматозоидов и функции. Таким образом, ему-5 или ему-8 самцов можно использовать вместо дикого мужчины типа для многих экспериментах.

2) выявление и изоляция мужчин

1. Изучить хвост морфологии червей, хвост мужчина червя округляется.
2. Выберите L4 мужчин сцене и передавать их на пластины NGM отобранный с Е. кишечной OP50, и пусть они растут в течение дня или двух. Рост безбрачия мужчин в отсутствие гермафродитов предотвратить потерю спермы и, таким образом большое количество сперматиды будут доступны во время эксперимента.
3. В день вскрытия, передача безбрачия мужчин на NGM пластины без бактерий и позволить им ползать в течение нескольких минут. Этот шаг помогает снять небольшой слой E. кишечной придерживался на поверхность червей. Кроме того, пипетки небольшой объем буфера M9 (6 г Na ₂ HPO _4, 3 г KH ₂ PO _4, 5 г NaCl, 0,25 г MgSO ₄ .7 H ₂ O на литр) в часовое стекло и передача мужчин в буфер.

3) Препарирование мужчин и в активации пробирке

1. Возьмите предметное стекло и отметьте небольшой круг, используя пап пера. Внесите 30-50 мкл 1X Средний сперматозоидов (50 мМ HEPES, 25 мМ KCl, 45 мм NaCl, 1 мМ MgSO _4, 5 мМ CaCl _2, 10 мМ глюкозы, рН 7,8) в пределах круга. Гидрофобные круг помогает сохранить сперму среду в пределах его границ.
2. Передача 5-10 мужчин на сперму среды.
3. Просмотр слайдов под микроскопом, удерживая два шприца с приложением 27 иглы на обеих руках.
4. Используйте одну иглу 'держать' червя и использовать другие иглы, чтобы сократить заднем конце мужчин выпустить сперматиды.
5. Резка червь обычно изгоняет огромного количества сперматид мгновенно. Сперматиды видны как минуту "гранулы" под стерео микроскопом. Однако, иногда часть или большинство сперматиды могут быть сохранены в туши. В этом случае, мягко "перетаскивания" туша за стекло может способствовать освобождению сперматиды от туши.
6. Для активации сперматид, рассекать червей в 1X Средний спермы содержащие проназы Е (20μg/ml), и пусть они сидят в течение 5 минут.
7. Не позволяйте слайды становятся сухими в любой момент времени эксперимента. Добавить еще 1X спермы среднего, если необходимо.

4) Визуализация spermtids и сперматозоиды

1. Аккуратно покровное на поверхности расчлененный образца.
2. Найти области сперматиды при малом увеличении (10х)
3. Мелкие детали сперматиды или сперматозоиды можно наблюдать при переходе на большем увеличении - как правило, на 100X иммерсионного масла.

5) представитель Результаты

Примером DIC образ сперматиды изолированы от мужчин C. Элеганс показано на рисунке 1. Сперматиды имеют сферическую форму и ядер занимают видное место. В пробирке сперматозоиды активированный показаны на рисунке 2.

Рисунок 1. DIC образ C. Элеганс сперматиды.

Рисунок 2. DIC изображение в пробирке активированный C. Элеганс сперматозоидов.

В дополнение к анализу Spe мутантов, этот протокол имеет и другие важные приложения, такие как анализ морфологии сперматозоидов со старением. Сперматиды и сперматозоиды выделяют, используя этот протокол можно использовать в других экспериментах вниз по течению, таких как, иммунной дикого типа и мутантных спермы ^{8, 9,} подвижность сперматозоидов на слайдах ^10, физиологических измерений ^{9, 11,} или даже искусственное оплодотворение ^12.