Isolamento e In vitro Attivazione di Caenorhabditis elegans Sperm

Singaravelu, G., Chatterjee, I., Marcello, M. R., Singson, A. Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm. J. Vis. Exp. (47), e2336, doi:10.3791/2336 (2011).

Maschi e ermafroditi sono le due forme naturalmente trovato sessuale nel nematode C. elegans. Lo sperma ameboidi sono prodotte da entrambi i maschi e ermafroditi. Nella prima fase della gametogenesi, le cellule germinali di ermafroditi differenziarsi in un numero limitato di spermatozoi - circa 300 - e sono memorizzati in una piccola 'borsa' chiamata spermateca. Più tardi, ermafroditi continuamente produrre ovociti ^1. Al contrario, i maschi producono esclusivamente spermatozoi per tutta la loro età adulta. I maschi producono spermatozoi così tanto che rappresenta> 50% delle cellule totali in un tipico ² verme adulto. Pertanto, isolare gli spermatozoi dei maschi è più facile che da quella di ermafroditi.

Solo una piccola percentuale di maschi sono naturalmente generati grazie alla spontanea non disgiunzione del cromosoma X ^3. Crossing ermafroditi con i maschi o più comodamente, l'introduzione di mutazioni a dare origine a Lui (alta incidenza di maschi) fenotipo sono alcune delle strategie attraverso cui si può arricchire la popolazione maschile ^3.

I maschi possono essere facilmente distinto da ermafroditi osservando i ⁴ morfologia coda. Coda ermafrodita è puntato, mentre la coda di sesso maschile è completato con le strutture di accoppiamento.

Taglio della coda rilascia vasto numero di spermatidi memorizzati all'interno del tratto riproduttivo maschile. La dissezione viene eseguita al microscopio stereo utilizzando aghi calibro 27. Dal momento che spermatidi non sono fisicamente connessi ad eventuali altre cellule, la pressione idraulica espelle contenuti interni del corpo maschile, tra cui spermatidi ^2.

I maschi sono direttamente dissezionato in una piccola goccia di 'Medium sperma'. Spermatidi sono sensibili a variazioni del pH. Quindi, HEPES, un composto con una buona capacità tampone viene utilizzato nei media sperma. Glucosio e altri sali in ambiente sperma aiutare a mantenere la pressione osmotica per mantenere l'integrità degli spermatozoi.

Post-meiotico differenziazione delle spermatidi in spermatozoi è chiamato spermiogenesi o l'attivazione dello sperma. Scuote ^{5, 6} e Nelson precedentemente dimostrato che l'spermatidi possono essere indotte a differenziarsi in spermatozoi con l'aggiunta di composti tra cui l'attivazione di vari pronasi E. Qui mostriamo in vitro spermiogenesi di C. spermatidi elegans utilizzando pronasi E.

Spermiogenesi successo è pre-requisito per la fertilità e quindi i mutanti difetti di spermiogenesi sono sterili. Finora molti mutanti hanno dimostrato di essere difettoso in particolare nel processo di spermiogenesi ^7. Anomalie rilevate durante l'attivazione in vitro di nuovi Spe (spermatogenesi difettoso) mutanti ci aiuterebbe a scoprire i giocatori aggiuntivi che partecipano a questo evento.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamo Samuel Ward, Diane C. Shakes e Gregory Nelson pionieristico per questa tecnica. Ringraziamo Pavan Kadandale e Brian Geldziler di video che mostrano gli spermatozoi attivi, i membri del laboratorio Singson per le discussioni utili; CGC per i ceppi e NIH per averci sostenuto con borsa (R01HD054681).

1. Kimble, J. & Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology 23, 405-433, (2007).
2. Lhernault, S. W. & Roberts, T. M. in Methods in Cell Biology, Vol 48 Vol. 48 Methods in Cell Biology 273-301 (1995).
3. Hodgkin, J., Horvitz, H. & Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics 91, 67-94 (1979).
4. Altun, Z.F. and Hall, D.H. Introduction to male C. elegans anatomy. In WormAtlas, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (2008).
5. Shakes, D. & Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol 134, 189-200, (1989).
6. Nelson, G. A. & Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell 19, 457-464 (1980).
7. L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology 306, 59-65, (2009).
8. Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D. & Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development 132, 2795-2808, (2005).
9. Xu, X. & Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell 114, 285-297, (2003).
10. Nelson, G., Roberts, T. & Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol 92, 121-131 (1982).
11. Machaca, K., DeFelice, L. J., & L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol 176, 1-16, (1996).
12. LaMunyon, C. & Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics 138, 689-692 (1994).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.