Всего-Cell Запись Кальций Release-активированный кальций (CRAC) Токи в лимфоцитах человека Т

1. Подготовка Отдых правам Т-лимфоцитов

1. Использование RosetteSep правам Т-клеток Коктейль по обогащению и среднего RosetteSep Плотность, очистить Т-клеток из человеческих образцов крови в соответствии с инструкциями производителя. В результате клеточной популяции должна содержать 95% CD3 ⁺ Т-клеток отдыха. Мы очищаем человека Т-лимфоцитов из периферической крови собранных от здоровых добровольцев в соответствии с протоколом, утвержденным Советом UC Davis Внутренняя проверка.
2. После изоляции, ресуспендируют отдыха Т-клеток при плотности 0,5 х 10 ^{6 клеток} / мл в ячейку культуральной среде, содержащей RPMI-1640 с глютамином и HEPES, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2% GlutaMAX-I, 1% RPMI 1640 витамин решение, 1% RPMI 1640 аминокислоты решение кислоты, 1% пируват натрия и 0,03% β-меркаптоэтанола.
3. Место клеточной суспензии во флаконы культуре клеток и поддерживать при температуре 37 ° С в увлажненной инкубаторе с 5% CO ₂ в течение 24 ч до эксперимента.

2. Подготовка Запись палаты

1. Ниже приведены необходимые для подготовки записи камер:) кремния уплотнительные кольца, б) круглое, 25-мм покровные очищать 70% этилового спирта и дистиллированной H ₂ O, в) смешанные Sylgard184, подготовленный в соответствии с инструкциями производителя, и г) два 60 х 15 мм чашки Петри.
2. Место ~ 0,5 мл смешанного Sylgard184 в 60x15 мм чашки Петри.
3. Опустите нижнюю часть О-кольцо в Sylgard184 использованием щипцов.
4. Удалите излишки Sylgard184 от края уплотнительного кольца путем размещения уплотнительного кольца на чистую поверхность, например, другой чашке Петри.
5. Место кольцо на покровное и нажмите на нее вниз.
6. Cure Sylgard184 при нагревании камеры при 85 ° С в течение 40-60 минут или до Sylgard184 полимеризуется.
7. Храните записи камер в пыли контейнер.

3. Подготовка Патч Пипетки

1. В день эксперимента, потяните пипетки с ~ 2 мкм, диаметр кончика использованием стеклянных капилляров и съемник пипетки. Мы используем боросиликатного трубка с нитью (диаметр: 1,5 мм и ID: 1,10 мм). Магазин пипетки в пыли месте.
2. Пальто наконечники с Sylgard184 или HIPEC R6101 Semiconductor Защитные покрытия, согласно стандартной процедуре ^9.
3. Осторожно пожарные польский пипетки до эксперимента.

4. Патч зажим установки подготовки

1. Настройка и сохранение макросов для gigaseal образования в программное обеспечение управления патч-зажим усилителя. Мы используем EPC-10 Усилитель поддерживает Windows XP и импульсный программного обеспечения для сбора данных. Мы устанавливаем "настройка", "по-клеток», и «цельноклеточная" макросы в соответствии с EPC-10 ручных и использовать их для всех экспериментов.
2. Подготовка ванны решений и пипетка Решения приведены в таблице 1 до эксперимента и хранить их при температуре 4 ° С не более 1 недели.

Таблица 1. Решения для целых клеток в канцерогенности текущей записи.

Все химические вещества были приобретены у компании Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.

3. Определите жидкости потенциалов перехода (ЖЖ) между решением патч пипетки и каждой ванны решение ^10. Сохранить значение LJ в нужном месте с помощью приобретения программного обеспечения. Например, в программе Импульсный вставки значения ЖЖ в "ЖЖ" контроля в "усилитель" окна.
4. Настройка и сохранение протоколов стимуляции, как показано на рисунке 1, в соответствующем месте вашего приобретения программного обеспечения до экспериментов. В импульсной программы, мы устанавливаем приобретение протокол в «Пульс Поколение" окна.
   
   Рисунок 1. . Стимуляция протокол напряжения рампы от -120 до +100 мВ 50 мс продолжительность применяется каждые 0,2 - 2 с (5 - 0,5 Гц). Холдинг потенциала (V _ч) между рампами поддерживается на уровне +30 мВ.

5. Монтаж ячеек на столике микроскопа

1. Пальто записи камер с _{поли-L-лизин} в течение ~ 20 минут и промыть H ₂ O, а затем с сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) перед покрытием клеток.
2. Пластина 500 мкл клеточной суспензии, содержащей 0,2-0,5 x10 ⁶ клеток в камере и инкубировать в течение 20 мин при 37 ° C.
3. Безопасная запись камеры с прикрепленным клеток в камере держателя. Мы используем заказ камеру держателя, где базы для поддержания нижней части покровного стекла, а верхняя часть слегка прижимается к верхней части покровного стекла.
4. Место камеры держатель на стадии инвертированного микроскопа.
5. Сосредоточьтесь на клетки в проходящем свете. Мы используем 40х целью погружения на нефть.
6. Место Ag / AgCl электрод в ванну.
7. Совместите multibarrel, гравитация управляемой системы перфузии. Кончик трубки приток должен быть размещен на углом 45 ° к покровным близко к полю зрения.
8. Поместите всасывающую трубку противоположной оконечности приток трубки.
9. Заливать камеру с фосфатным буферным раствором (PBS) или HBSS, чтобы смыть культуры клеток и свободно прилагается клеток.

6. CRAC канала Токи Запись

1. Найти ячейку, которая прочно прикреплены к покровным. Как правило, мы выбрать среднего размера, круглые клетки с гладкой внешней поверхностью.
2. Заливать записи камеры с Са ^{2 +-бесплатно,} 3 мМ Mg ^{2 +-содержащих} ванны решение № 1 (Таблица 1), содержащая 0,5-1 мкМ thapsigargin в течение 8-10 мин для блокирования насоса SERCA. Мы выполняем этот шаг, чтобы истощать хранить до gigaseal образования.
3. Использование Эппендорф microloader и П-20 смещение пипетки, заполните патч пипетки с решением пипетки (табл. 1) и вставьте патч пипетки в пипетку держатель на усилитель headstage. Са ^{2 +} хелатором BAPTA включен в решение пипетку, чтобы пассивно разрушающих хранить и снизить Са ^{2 +-зависимые} CRAC инактивации каналов.
4. Нанесите небольшое количество положительного давления (~ 3 дюймов Н ₂ О) внутри патча пипетки перед входом в ванну. Мы используем заказ напорно-всасывающие устройства, подключенного к сжатый воздух и вакуумные линии для создания положительного или отрицательного давления внутри патча пипетки.
5. Нижняя патч пипетки в ванну под визуальным контролем через микроскоп. В "осциллограф" окно, вы должны увидеть ток, протекающий через пипетку. Ступенчатое изменение амплитуды тока должна быть вызвана небольшой импульс напряжения амплитудой (тестовый импульс), применяемых заданного макроса. В это время, вы должны быть в состоянии определить значение сопротивления пипетки. Сопротивления наших пипетки, как правило, 5-6 МОм.
6. Правильная "смещение" потенциал, создаваемый между пипеткой и электрода сравнения.
7. Под визуальным контролем через микроскоп, довести пипетки ближе к клетке, пока она не коснется клеточной мембраны.
8. Применить отрицательного давления (20-40 дюймов Н ₂ О) внутри патча пипетки.
9. Монитор gigaseal образования в "осциллограф" окна. Вы увидите, амплитуда тока, индуцированного теста пульс, снижается и стоимость пипетки сопротивление возрастает до> 5 ГОм. Обычно gigaseal формы, в Feш секунд, но это может занять 1-2 мин для достижения стабильного gigaseal.
10. Компенсировать емкость пипетки ("C-Fast").
11. Перерыв патч мембраны с применением дополнительного отрицательного давления с помощью 20 мл шприца.
12. Установить проведения потенциал до +30 мВ. Положительный потенциал холдинга помогает предотвратить кальций-зависимых каналов CRAC инактивации.
13. Компенсировать мембраны емкость ячейки ("C-медленно"); сохранять или записывать значение C-медленно.
14. Проверьте значение доступа сопротивления "Р _С". В наших экспериментах, Р _С, как правило, 7-20 МОм.
15. Начать применять серию напряжения рампы с частотой 0,5 Гц (рис. 1) в Са ^{2 +-свободные} 3 мМ Mg ^{2 +-содержащих} ванны решение № 1. В этом решении, CRAC тока пренебрежимо мала по сравнению с "утечка" тока из-за плохой проницаемости CRAC каналов для Mg ^{2 +.} Сохранение и использование текущей следы записан в ванной решение № 1 в будущем анализы, как «утечка» токов. Абсолютная амплитуда "утечка" тока при -100 мВ должна быть меньше или равна 5 мкА. Если ячейка "дырявые", остановить эксперимент и начать все заново с использованием новой пипеткой патч и новые клетки.
16. Для записи Са ^{2 +} ток по каналам CRAC (я _Са-CRAC), заменить Са ^{2 +-свободные} 3 мМ Mg ^{2 +-содержащих} ванны решение № 1 с 20 мМ Са ^{2 +-содержащих} ванны решение № 2 (табл. 1) за счет перехода перфузии клапанов. Это позволяет Са ^{2 +} течь через CRAC каналов и производить внутренний ток. В "осциллограф" окно, вы увидите развитие внутренне исправления я _Са-CRAC (рис. 2). Амплитуда тока при отрицательных напряжениях будет продолжать расти в течение приблизительно 1 мин из-за Са ^{2 +-зависимые} потенцирование CRAC тока.
17. Увеличение частоты стимуляции напряжением рампы до 5 Гц, которая необходима для записи переходных Na ⁺ ток через CRAC каналов.
18. Замените 20 мМ Са ^{2 +-содержащих} ванны решение № 2 с Na ^{+-содержащие} двухвалентных катионов без решения № 3 (табл. 1) за счет перехода перфузии клапанов. В "осциллограф" окна, вы увидите, переходные развитие большей амплитудой внутренне исправления Na ⁺ ток через каналы CRAC (я _Na-CRAC; рис. 2).
19. Можно применить 20 мМ Са ^{2 +-содержащие} ванны решение # 2, содержащих 1-5 мкМ La ^{3 +} в конце эксперимента для записи "утечка" тока. Тем не менее, мы не нашли такого подхода полезно, потому что "утечка" тока изменяется с течением времени и он может стать больше или меньше в конце эксперимента. Мы предпочитаем брать текущие записан в Са ^{2 +-свободные} 3 мМ Mg ^{2 +-содержащих} ванны решение № 1 в начале эксперимента как "утечка" тока.
20. Сохранить записанные текущие следов для последующего анализа.

7. Анализ данных

1. Получить сохранены текущие записи в программное обеспечение для анализа. Мы используем импульсный программы для анализа.
2. Мера амплитуды тока в начале и в конце напряжения рампы. Мы обычно измеряют амплитуды тока при -100 мВ и на +100 мВ использованием пары курсоры в "осциллограф" окно Импульсный программы.
3. Экспорт значения амплитуды тока в графической программе для дальнейшего анализа и графического представления. Мы используем Происхождение Научно графиков и программное обеспечение для анализа, версия 7.

8. Представитель Результаты

Рисунок 2. CRAC токов в отдыхают человека Т-клеток. (), Time ходе CRAC токи, записанные в цельноклеточной напряжения зажим конфигурации при -100 мВ (темные кружки) и +100 мВ (кружки). До gigaseal образование, клетки предварительно инкубировали в течение ~ 10 мин в Са ^{2 +-свободные} 3 мМ Mg ^{2 +-содержащих} ванны решение № 1, содержащий 0,5 мкМ thapsigargin. После взлома, ванна решения были последовательно применяются следующим образом: Ca ^{2 +-свободные} 3 мМ Mg ^{2 +-содержащих} ванны решение # 1 (0 + 3 Ca Mg), затем 20 мМ Са ^{2 +-содержащих} ванны решение № 2 (20 Са), а затем двухвалентных катионов без ванны решение № 3 (DVF), затем ванна решение # 2 (20 Са). Ячейка стимулировали серию напряжения рампы, как показано на рисунке 1. Частота рампы составила 5 Гц в ванной решение № 3 (DVF) и 0,5 Гц во всех других решений. Обратите внимание на медленное развитие _{Я-Са CRAC} после применения 20 мМ Са ^{2 +-содержащих} ванны решение № 2 и быстрые переходные развитие Я _Na-CRAC в DVF ванны решение № 3. (B), представитель текущей следы выявлены в ходе напряжение рампы в Са ^{2 +-свободные} 3 мМ Mg ^{2 +-содержащих} ванны решение № 1 ("Утечки"), 20 мМ Са ^{2 +-содержащих} ванны решение # 2 (20 Ca), и ванной решение № 3 (DVF). (C, D), ток-напряжение отношений _{Я-Са CRAC} (C), и я _Na-CRAC (D), полученных путем вычитания "утечки" тока от токов записаны во время напряжения рампы в 20 мМ Са ^{2 +-содержащих} ванны Решение № 2 (20 Ca), и ванной решение № 3 (DVF) показано на графике (B).

Электрофизиологические исследования CRAC токи в состоянии покоя человека Т-клеток является сложной задачей, поскольку эндогенный CRAC амплитуды тока в этих клетках мало из-за небольшого размера ячейки (отдыха человека Т-клеток диаметром в диапазоне 5-8 мкм). Здесь мы представляем шаг за шагом процедуры надежно записи CRAC токи в состоянии покоя человека Т-лимфоциты изолированы от мононуклеарных клеток периферической крови. Эта технология позволяет исследовать физиологию и функциональные выражения CRAC каналов в состоянии покоя Т-клетки, чтобы лучше понять природу нормальных и патологических иммунных реакций клеток. Используя этот протокол, можно измерить CRAC токи в состоянии покоя человека Т-клеток, а также в другие клетки иммунной системы, таких как активированный человеческий Т-клеток, моноцитов и макрофагов.