利用生物发光成像之间调查的协同作用肺炎链球菌 A型流感病毒的婴儿小鼠

Short, K. R., Diavatopoulos, D. A., Reading, P. C., Brown, L. E., Rogers, K. L., Strugnell, R. A., et al. Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice. J. Vis. Exp. (50), e2357, doi:10.3791/2357 (2011).

在1918年的流感病毒大流行，全球约50亿人死亡，死亡的多数是不单独与流感病毒感染的结果。相反，大多数人认为死于继发性细菌感染，他们主要由肺炎链球菌 （肺炎球菌）引起的。由流感病毒和肺炎球菌引起的感染之间的协同关系，随后被观察到在1957年的亚洲流感病毒大流行，以及在季节性暴发的病毒^（1，2审查）。在这里，我们描述机制（S）作为并发A型流感病毒和S.增加发病率可能会在参与调查的协议肺炎衣原体感染。我们已经开发出一个婴儿的小鼠模型可靠和可重复的展示与S殖民统治的小鼠流感病毒感染的影响肺炎 。使用此协议，我们提供了共同安置在体内成像^3，新生小鼠肺炎球菌之间的传输动力学的第一洞察力。

1。制备生物发光S.传染病股肺炎

1. 接种含有0.5％（W / V），酵母提取物和血琼脂小块， 与发光S.补充10毫升托德休伊特肉汤一个麦卡特尼管肺炎静态和成长在37 ° C至光密度0.40-0.45（600nm处）。
2. 湿冰5分钟的文化广场，逮捕在这个成长阶段的细胞。
3. 10毫升中旬日志增长阶段S.肺炎添加1毫升80％（V / V）甘油和组合成所需的卷分装并储存于-70 ° C。
4. 确定感染剂量的发光南肺炎库存血琼脂平板连续稀释的活菌数。

2。 A型流感病毒的生长和制备

1. A型流感病毒是生长在10日龄鸡胚尿囊液。
2. 与A型流感病毒在37℃水浴解冻小瓶。
3. 使用一个光源放在蛋壳上的气囊的基础静脉点的位置在airsac（烛），马克。
4. 用70％乙醇擦拭消毒的鸡蛋表面，并擦拭干净。
5. 皮尔斯在气囊只是上面使用一个珠宝商的隶标志小孔。
6. 与鸡蛋定位在一个纸箱与空气囊至上，使用13毫米1ml注射器和26G针接种适当稀释的A型流感病毒通过在外壳上的孔0.1ml的每个鸡蛋。点到尿囊腔针直接向下，穿出airsac。
7. 融化的蜡封洞，并在加湿孵化2天，于35℃孵育的鸡蛋经过2天的潜伏期，蜡烛的鸡蛋，以检查血管的存在，以确认胚胎仍然活着。如果鸡蛋里面是黑色的，胚胎已经死亡和蛋应丢弃，而不是用于A型流感病毒的收获。
8. 将鸡蛋在4 ° C过夜，以杀死胚胎和收缩血管，以尽量减少破坏的船只，血液和病毒之间的接触会导致病毒结合到红细胞。
9. 第二天，用70％乙醇擦拭消毒的鸡蛋面。
10. 在II级生物安全柜工作，收集尿囊液，含有流感病毒的鸡蛋。取出蜡，用弯剪刀削减各地的鸡蛋的顶部，以消除上述尿囊膜的气囊。
11. 穿刺尿囊膜，用无菌钳剥开。
12. 用10毫升无菌吸管吸尿囊液，同时与另一个无菌吸管一侧的胚胎。收集于50ml管汇集的尿囊​​液，并在任何时候都保持在冰上。如果尿囊液是血性或含有蛋黄不添加到池。
13. 为5min离心尿囊液，在室温下在2000 RPM，清除杂物。
14. 分装在1-2毫升cryotubes和存储的感染尿囊液在-70 ° C
15. 确定流感解冻的尿囊液中的3个独立执行的斑块形成Madin Darby狗肾细胞（见下文）检测病毒滴度。每个实验中，使用新的病毒等份。重复冷冻解冻将减少感染性滴度。

3。鼻内感染小鼠与发光S.肺炎和/或A型流感病毒

1. 冷冻解冻股票的发光S.肺炎和稀释至所需剂量的PBS。
2. 轻轻地拿起5天的食指和拇指之间的老年小鼠，并保持直立。使用吸管下降发光S。肺炎在3μl卷到鼻孔。等待，直到所有的接种前放置在笼子里的鼠标背部吸入。使用模拟感染的PBS3μl。
3. 定植后三至9天，与发光 S. 肺炎 ，解冻等份，含A型流感病毒的尿囊液，用PBS稀释至所需浓度。在步骤3.2中所述的3μlPBS量A型流感病毒感染小鼠。使用稀释的尿囊液3μl，从模拟病毒感染未被感染的鸡蛋。
4. 通过观察其外观，行为，身体状况，在≤3天的的小鼠，牛奶斑的存在，每天监测小鼠的福利。一个人性化的结束点的指导和干预标准应制定实验动物兽医（见表3）协商。

4。生物发光成像使用IVIS频谱（卡尺生命科学）

1. 注射水，准备在0.75 mg / ml和甲苯噻嗪1.76mg/ml氯胺酮的混合物。
2. 麻醉小鼠，注入腹腔100μl/10g体重腔。
3. 将成像盒麻醉小鼠。仔细应注意保持利益并行的解剖区域时，相机将鼠标内部的成像盒/室。
4. IVIS小鼠放置盒，并允许在0.5 L / min的维持麻醉成箱的异氟醚的条目。
5. IVIS机设置正确的成像平台和分级，并捕获7分钟的形象。
6. 允许在加热箱（如使用隔热垫）从麻醉中恢复，然后再返回家笼的小鼠。
7. 图像分析和调整，以同样的规模，使用的生活图像软件包3.0版（卡尺生命科学版）。
8. 在选定的区域利益的生物发光信号可以量化为总光通量（光子/秒）或平均辐射率（光子/秒^/厘米2 / SR ）。

5。组织处理，以确定细菌和病毒滴度

1. 小鼠是人道毁灭CO ₂窒息的皮毛消毒用70％的乙醇。
2. 固定硬砧板上的动物。
3. 通过动物的头中间，用消毒的手术刀刀片，切开始后，弯曲每头向外的一面暴露鼻咽部。
4. 通过使用无菌镊子和地方的负责人在1.5ml的冰冷的RPMI各占一半刮组织，收集每个动物的鼻咽癌组织。置于冰上。
5. 打开胸腔，用剪刀，并用无菌镊子和剪刀，取出肺。冲洗肺部的3倍的PBS，以消除任何血液和收集在1.5ml的冰冷的RPMI。置于冰上。
6. 使用均质机均质组织，地方上冰。
7. 删除匀浆组织等分，并用它来确定细菌负荷。准备组织匀浆和板块上的HBA系列稀释。培养板在37 ° C为18-24小时，并确定可行的计数。然后，可以在一个特定的器官细菌滴度与在该地区观察到的光子数目。
8. 离心机匀浆组织的其余部分在3500转速为10分钟，在4 ° C。干净，无菌管收集上清和转让。商店上清于-70 ° C和斑块的检测，确定病毒滴度。

6。斑块的检测，以确定组织匀浆中的A型流感病毒的滴度

1. 斑块形成融合单层Madin Darby狗肾细胞（MDCK）是由病毒感染性滴度。 RF10（见表1）在组织培养瓶（NUNC）MDCK细胞常规培养和传代时汇合。
2. 分离MDCK细胞组织培养瓶使用胰蛋白酶。在RF10清洗细胞，并在5分钟1200转离心收集细胞。弃上清，重新悬浮颗粒细胞中的RF10。计数MDCK细胞使用血球和重要的染料。种子每35毫米6孔板（NUNC）1.2x10 ⁶ MDCK3毫升RF10和培养细胞中的细胞在37 ° C和5％的_CO 2达到汇合（〜24小时） 。
3. 准备莱博维茨dsL15媒体和1.8％（W / V）琼脂糖覆盖媒体（见表1）。分装dsL15媒体和1.8％（W / V）琼脂糖于50ml无菌瓶。 dsL15媒体保持在4 ° C直到使用和琼脂糖在56 ° C，直到使用。
4. 检查，MDCK细胞单层融合和洗吸RF10和取代它与细胞用RPMI +〜1.5毫升的RPMI +。在任何过程中的阶段，板块应该被允许完全干燥。板块在37 ° C，直到准备添加含有病毒的样本。
5. 准备在RPMI系列稀释的病毒样本+。继续，直到用冰的样品。
6. 吸的RPMI单层+ +适当稀释的病毒样本，每孔加入135uL的RPMI。每个样品重复测试。
7. 孵育45分钟的病毒样本的MDCK细胞在37 ° C和5％的CO _2。轻轻摇动板，每15分钟均匀散布病毒，并防止干燥的MDCK细胞单层。
8. 移动琼脂糖从56 ° C至46 ° C水浴和温暖dsL15媒体46 ° C的水浴。
9. 45分钟潜伏期病毒对MDCK细胞单层后，采取板块5％的CO ₂培养箱。取出46℃水浴琼脂糖和L15媒体。加入0.1％胰蛋​​白酶悬液0.2ml dsL15媒体50毫升，比添加50毫升的dsL15 +胰蛋白酶50毫升的1.8％（W / V）的琼脂糖。混合琼脂糖和L15的轻轻和添加覆盖中等3ML，每孔6孔板。轻轻覆盖，以确保整个MDCK细胞单层的漩涡。一旦重叠设置孵化板在37 ° C和5％CO ₂为2-4天。
10. 在潜伏期结束，计数斑块数量作为衡量病毒infectiviTY。如果有必要，斑块可单层甲醇溶解的结晶紫染色观察。

7。 C节 - 成功的秘诀：

1 与 S的所有的实验工作肺炎 （如液体培养接种肺炎链球菌感染小鼠的组织处理），在II级生物安全柜。

1.1我们创建发光S。通过引入质粒pPJTG28 ³株肺炎 。然而，各种各样的不同发光南可用4-6株肺炎 。生物发光S。株肺炎 ，也可购买从卡尺生命科学公司（马萨诸塞州，美国） 。

1.1各种S.的生长动力学株肺炎可能会有所不同，并应确定每一株。这可能需要3至4小时之间达到OD600nm = 0.4至0.45。

1.4我们通常会想到传染病的股票达到10e8 CFU / ml的浓度和稀释范围从10E - 4建议10E - 8确定活菌浓度。

2.6适当滴度接种蛋，取决于使用的病毒株，并可能范围，从10E - 3 10E - 5。从组织培养上清获得的A型流感病毒株，有时可能会被用来整齐。

3.2A我们经常使用2000的S. CFU殖民肺炎应变EF3030 5天的³岁的小鼠。确切的感染剂量的接种是确定每个实验追溯马血琼脂平板上镀系列稀释的接种。的S.能力肺炎应变殖民小鼠首先确定在几个时间点（如鼻咽，肺）接种后的小鼠组织匀浆活菌计数。

3.2b这是没有必要使用anaestetics管理的细菌或病毒通过吸入动物。婴儿小鼠（以及成年小鼠）应克制的手，并举行调查直立，接种（3微升婴儿小鼠，成年小鼠10微升），然后下降到鼻孔和吸入接种通过观察证实。

3.2c卸下一个个从巢与细菌或病毒需要接种新生小鼠。标记动物的尾巴，使用永久性标记，如果有必要，并返回的动物笼立即。擦一些铺垫材料的动物，使大坝将接受入巢的仔兔。注：永久性标记擦掉动物迅速，需要每天须重新申请。另外，纹身系统可用于识别动物个体。

3.3我们使用20 PFU A型流感病毒Udorn/307/72（H3N2）感染8至14日龄小鼠3。在动物中观察到的死亡率和发病率将取决于应变的 S. 肺炎和A型流感病毒使用。表3提供了一套有用的人性化的终点和干预的标准，使用小鼠的年龄超过21天岁的年轻人。我们通常不检测任何死亡率或发病率时使用S。 EF3030 肺炎和流感病毒株Udorn/307/72（H3N2）小鼠是10天。

4.2是准确的，老鼠可以权衡前注射麻醉剂的解决方案。作为指导，约50-75微升麻醉剂的溶液是用于20日龄小鼠。鼠标是完全麻醉，没有响应时在尾部或后肢一掐。虽然在IVIS，老鼠也将暴露异氟醚会增加麻醉。感染小鼠后，成像时间取决于 S的应变（S ） 肺炎和A型流感病毒，以及对利益的症状。执行少量的试点实验，以优化生物发光成像的时间可能是必要的。

4.3小鼠可以被放入隔离箱（防止污染物进入或退出框），另外，可以直接放入成像仪。我们婴儿小鼠实验中使用的隔离盒，以确保在成像过程中麻醉的老鼠仍然和防止污染与S的IVIS 肺炎和/或A型流感病毒。

4.3使用的小鼠腹侧形象获得呼吸道形象。一个鼠标的侧面图像，提供了一个耳朵更敏感的形象。

4.4小鼠放在直接进入会议厅时，异氟醚被传递到通过鼻锥的老鼠。对于婴儿小鼠实验中，隔离盒是首选，因为不适合婴儿小鼠鼻锥。

4.5 T他拍摄图像所需的总曝光时间可能会有所不同之间的实验根据的发光信号强度，信号，菌株的位置和所使用的小鼠品系。关于后者，色素和毛皮都可以显着减轻总的检测信号。 IVIS频谱上的相机背减薄，背面照明的CCD提供一个宽广的动态范围（65536级灰度）。理想的情况下，曝光时间，应设置为捕捉60至60,000计数。在我们的经验与C57BL / 6小鼠，增加成像时间超过7分钟，不显着提高信噪比。增加发光信号的备选方案包括增加程度分级（即大），并使用较小的领域的观点。重要的是，量化不应该进行内含有饱和像素的图像的地区，因为这提供了一个检测到的光子数量低估的价值。如果不能确定的最佳条件，自动曝光功能，可以用来作为一个准则。

4.5如果在鼠标的发光信号强烈阻碍在附近地区的生物发光检测，鼠标选定的区域，可以用黑纸和成像覆盖，可以继续正常

4.7如果发光信号量化光子（相数）之间的实验成像条件的变化（如成像时间）不会影响测量的发光信号。

4.8如果使用的总流量来衡量在一个指定区域的光子，确保使用相同的形状“感兴趣区域”是对所有样品。

5.1A鼠标可以被安乐死与A型流感病毒在感染后的任何时间点，取决于研究者的兴趣。我们通常在感染后6天确定的细菌和病毒的滴度与A型流感病毒Udorn/307/72（H3N2）和不遵守任何死亡率/发病率。然而，在这些实验中观察到的死亡率和发病率会有所不同的肺炎链球菌和使用A型流感病毒株和chosed时间点应考虑死亡率和发病率，以尽量减少对动物福利的影响。表3提供了一个有益的指导，干预的标准和人性化的端点，在这些实验中使用的。一般来说，老鼠是安乐死和组织处理后3小时内体内生物发光成像。

年龄超过10天的5.1B小鼠抗缺氧和斩首安乐死。在描述实验装置，小鼠至少14天的，可能是由CO ₂窒息安乐死。

5.7血琼脂平板可辅以5μg/ml庆大霉素，以防止在鼻腔组织匀浆的共生细菌的生长。用于稀释的范围将取决于的 S.用于肺炎链球菌株。在20日与 S老年小鼠实验肺炎应变EF3030，我们用整齐，10E - 1，10E - 2和10E - 3。

5.8商店匀浆组织至少在两等份，使每个样品的备份样品是可用的情况下，病毒斑块检测失败！一个准确的病毒滴度只能获得样品解冻后冻结，但不能从样品反复冻融一次。

6.1增长90-100％融合时，会产生一个单一的^150厘米 2组织培养瓶5 6孔板足够的MDCK细胞。

6.5最佳的连续稀释，将取决于使用的病毒株，感染后的时间。通常情况下，我们将使用A型流感病毒感染后6天，采取的器官组织匀浆整齐，10E - 1和10E - 2的稀释。

6.6病毒的股票连续稀释使用适当的使用在每个斑块检测的阳性对照。作为阴性对照，RPMI +都可以使用。

8。代表性的成果：

图1。鸡胚鸡蛋的示意图。

图2 S 的劳保局肺炎支原体感染3和第4天天模拟感染流感病毒后的鼠标。

图3 S 的劳保局肺炎和流感病毒共同感染小鼠对流感病毒感染后3天，每天4。

图4：在一个单一的鼻子和共同感染的细菌负荷特德鼠标。

图5在鼻子和共同感染小鼠肺病毒滴度。

表1：在本议定书中所使用的特定媒体。

表2：特定的试剂和仪器 。

表3。婴儿小鼠的干预标准（<21天）：

^当一个或多个“轻度至中度”的招牌，观察增加观测频率，每天两次，并在适当情况下，使治疗和护理可以从动物福利官员寻求建议。

^B当一个或多个“严重”的迹象观察，人道毁灭的小鼠使用适当的方法。 <10天的小鼠断头安乐死，10天的小鼠_安乐死 CO 2窒息。

IVIS机体内成像是一种独特的方法，使实时的可视化的^{微生物的发病} 4 ，6-9。在这里，我们展示了这项技术的应用，以了解南之间的协同作用婴儿小鼠肺炎和流感病毒。由于这项技术的非侵入性的性质，我们已经能够监测感染的进展在每一个人随着时间的推移鼠标。这使我们共同居住的婴儿^小鼠 3文件之间的肺炎球菌传播的动力学。这项技术的非侵入性使研究人员能够使用较少，每实验动物，从而减少动物的使用。它也可以使用IVIS机，可视化的传播感染，在体内感染以前未知的网站，以及不容易被清扫（如中耳）采样地点。

成像实验开始之前，我们证实，发光EF3030应变的殖民化水平与殖民父EF3030列举组织匀浆活菌计数的应变水平。此外，我们首次证实流感病毒感染导致发光EF3030负荷增加鼻咽殖民父EF3030株（结果未显示）表明动物。

IVIS技术虽然易于操作，并产生重现性好，易于理解的数据，实验必须精心设计，使该技术的敏感性和实用的最大化。例如，IVIS相机的灵敏度是影响的深度和不透明的^组织8，这在我们的经验，增加的检测限为来自肺部的发光信号。此外，深色皮毛和皮肤色素减少高达10倍（无毛小鼠相比^）8的光传输。发展这种方法的同时，我们也使用5至14日龄C57BL / 6小鼠进行了优化本议定书，并自表明，IVIS可以用来检测20日龄C57BL / 6小鼠的定植与发光S. 肺炎 EF3030。然而，信号检测，这些裸体或BALB / c小鼠进行实验时，可能会增加。然而，IVIS相机代表了一种新的方法来监测，鉴定和最终理解A型流感病毒感染后在体内的肺炎球菌病的发展。

生产这种视频文章赞助卡尺生命科学。

作者要感谢大卫Briles（在伯明翰，AL，美国阿拉巴马大学）的技术咨询。我们想感谢有益的建议和讨论关于动物福利与伦理和干预的标准和人性化的终点的发展所描述的实验伊薇特陈，墨尔本大学的动物福利主任，和大卫泰勒，动物设施经理，在这个手稿。

Odilia Wijburg和帕特里克读由NHMRC RD莱特奖学金的支持，科斯蒂短是由葛兰素史克研究生支援津贴和Puzey奖学金支持。

1. Brundage, J.F. & Shanks, G.D. Deaths from bacterial pneumonia during 1918-19 influenza pandemic. Emerg Infect Dis 14, 1193-9 (2008).
2. Petersdorf, R.G., Fusco, J.J., Harter, D.H. & Albrink, W.S. Pulmonary infections complicating Asian influenza. AMA Arch Intern Med 103, 262-72 (1959).
3. Diavatopoulos, D.A., et al. Influenza A virus facilitates Streptococcus pneumoniae transmission and disease. Faseb J (2010).
4. Orihuela, C.J., Gao, G., Francis, K.P., Yu, J. & Tuomanen, E.I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J Infect Dis 190, 1661-9 (2004).
5. Kadurugamuwa, J.L., et al. Noninvasive monitoring of pneumococcal meningitis and evaluation of treatment efficacy in an experimental mouse model. Mol Imaging 4, 137-42 (2005).
6. Smith, M.W., Schmidt, J.E., Rehg, J.E., Orihuela, C.J. & McCullers, J.A. Induction of pro- and anti-inflammatory molecules in a mouse model of pneumococcal pneumonia after influenza. Comp Med 57, 82-9 (2007).
7. Owen, S.J., et al. Nasal-associated lymphoid tissue and olfactory epithelium as portals of entry for Burkholderia pseudomallei in murine melioidosis. J Infect Dis 199, 1761-70 (2009).
8. Luker, G.D. & Leib, D.A. Luciferase real-time bioluminescence imaging for the study of viral pathogenesis. Methods Mol Biol 292, 285-96 (2005).
9. Hutchens, M. & Luker, G.D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol 9, 2315-22 (2007).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.