Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

Short, K. R., Diavatopoulos, D. A., Reading, P. C., Brown, L. E., Rogers, K. L., Strugnell, R. A., et al. Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice. J. Vis. Exp. (50), e2357, doi:10.3791/2357 (2011).

Under 1918 influensavirus pandemi, som dödade cirka 50 miljoner människor världen över, var majoriteten av dödsfallen inte resultatet av infektion med influensavirus ensam. Istället är de flesta individer tros ha fallit för en sekundär bakteriell infektion, huvudsakligen orsakas av bakterien Streptococcus pneumoniae (den pneumokocker). De synergieffekter mellan infektioner orsakade av influensavirus och pneumokocker har därefter observerats under 1957 asiatiska influensavirus pandemi, liksom under säsongens utbrott av viruset (över ^{1, 2).} Här beskriver vi ett protokoll som används för att undersöka den mekanism (er) som kan vara inblandade i ökad sjuklighet till följd av samtidiga influensa A-virus och S. pneumoniae infektion. Vi har utvecklat ett spädbarn mus modell för att tillförlitligt och reproducerbart påvisa effekter av influensavirusinfektionen av möss koloniserade med S. pneumoniae. Användning av detta protokoll har vi lämnat den första inblick i kinetiken av pneumokocker överföring mellan co inrymt-, neonatala möss med in vivo imaging ^3.

1. Beredning av smittsamma lager av Bioluminescent S. pneumoniae

1. Inokulera en McCartney rör som innehåller 10 ml Todd-Hewitt buljong kompletterad med 0,5% (w / v) jästextrakt och en liten bit av blodagar med självlysande S. pneumoniae och växa statiskt vid 37 ° C till optiska densitet (600 Nm) på 0,40-0,45.
2. Placera kultur på is i 5 minuter för att arrestera de celler i denna tillväxtfas.
3. Till 10 ml mitten log tillväxtfas S. pneumoniae tillsätt 1 ml 80% (v / v) glycerol och blanda, uppmätt i den önskade volymer och förvaras vid -70 ° C.
4. Bestäm smittsam dos av självlysande S. pneumoniae lager av bakterieräkning i spädningar på tallrikar blodagar.

2. Tillväxt och Beredning av influensa A-virus lager

1. Influensa A-virus odlas i allantoisvätska av 10-dagar gamla embryonerade hönsägg.
2. Tina en injektionsflaska med influensa A-virus i 37 ° C vattenbad.
3. Med hjälp av en ljuskälla placerad över airsac (genomlysning), märke på äggskalet platsen för den Luftsäcken i en punkt utan underliggande vener.
4. Desinficera ytan på äggen genom att torka med 70% etanol och torka rent.
5. Pierce ett litet hål i Luftsäcken precis ovanför märket med en juvelerare skrivare.
6. Med äggen placeras i en kartong med Luftsäcken översta, använd en 13mm 1 mL spruta och en 26G nål för att inokulera varje ägg genom hålet i skalet med 0,1 ml av lämpligt utspädd influensa A-virus. Rikta nålen direkt nedåt i allantoiskaviteten, piercing airsac.
7. Täta hålet med smält vax och ruvar äggen i 2 dagar i en fuktig ägg inkubator vid 35 ° C. Efter 2 dagars inkubation, ljus äggen för att kontrollera förekomsten av blodkärl för att bekräfta att embryot fortfarande lever. Om ägget är svart inuti, har embryot dött och ägget skall kasseras och får inte användas för skörd av influensa A-virus.
8. Placera äggen vid 4 ° C över natten för att döda embryon och att tygla blodkärl för att minimera störningar av fartygen, som kontakt mellan blod och virus skulle resultera i bindande av virus till röda blodkroppar.
9. Nästa dag, desinficera ytan av ägg genom att torka med 70% etanol.
10. Arbeta i en klass II biosäkerhet kabinett för att samla in allantoisvätska innehåller influensa A-virus från ägg. Ta bort vaxet och använda böjd sax för att klippa runt toppen av ägget att ta bort Luftsäcken ovanför allantois membranet.
11. Punktering och skal tillbaka allantois membranet med hjälp av steril pincett.
12. Aspirera allantoisvätska med en steril 10 ml pipett samtidigt som du håller embryot till en sida med en annan steril pipett. Samla poolade allantoisvätska i 50mL rör och hålla på isen hela tiden. Om allantoisvätska är blodiga eller innehåller äggula inte lägga till poolen.
13. Centrifugera allantoisvätska för 5min vid 2000 rpm vid rumstemperatur för att ta bort skräp.
14. Alikvotera den smittsamma allantoisvätska i 1-2 ml cryotubes och förvara vid -70 ° C.
15. Bestäm influensa A-virus titer tinas allantoisvätska i 3 självständigt utfört plack bildas tester på Madin-Darby Canine Kidney celler (se nedan). Använd en ny portion av virus för varje experiment. Upprepad frysning-upptining kommer att minska smittsam titer.

3. Intranasal infektion av möss med självlysande S. pneumoniae och / eller influensa A-virus

1. Tina frysta lager av självlysande S. pneumoniae och späd till önskad dos i PBS.
2. Försiktigt plocka upp 5 dagar gamla möss mellan pekfingret och tummen och hålla upprätt. Använd en pipett för att släppa självlysande S. pneumoniae på näsborrarna i en volym av 3μl. Vänta tills alla inokulat andas in innan du placerar musen tillbaka i buren. Användning 3μl PBS för prototyper infektion.
3. Tre till nio dagar efter kolonisation med självlysande S. pneumoniae, tina en alikvot av allantoisvätska med influensa A-virus och späd i PBS till önskad koncentration. Infektera möss med influensa A-virus i en volym av 3μl PBS som beskrivs i steg 3,2. Användning 3μl av utspädd allantoisvätska från oinfekterade ägg för mock-virusinfektion.
4. Övervaka välfärd möss dagligen genom att observera deras utseende, beteende, kondition och i möss som är ≤ 3 dagar gamla, förekomsten av mjölk fläckar. En guide för humana slutpunkter och kriterier ingripande bör utvecklas i samråd med försöksdjursvetenskap veterinär (tabell 3).

4. Bioluminescent avbildning med IVIS Spectrum (klave Life Sciences)

1. Förbered en blandning av ketamin på 0,75 mg / ml och xylazin 1.76mg/ml i injicerbara vatten.
2. För att söva möss, injicera 100μl/10 g kroppsvikt i peritonealdialyshålighet.
3. Placera sövda möss i bildbehandling rutan. Noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt att hålla anatomiska regionen av intresse parallellt med kameran när du placerar musen insidan av imaging låda / kammare.
4. Placera låda med möss i IVIS och låt isofluran inträde i rutan till 0,5 l / min för att upprätthålla anestesi.
5. Ställ IVIS maskin till rätt bildbehandling plattform och binning och fånga bilden för 7 minuter.
6. Låt möss att återhämta sig från anestesi i en uppvärmd låda (t.ex. med hjälp av en värmedyna) innan han återvände till buren.
7. Bilderna analyseras och justeras till samma skala med levande bild mjukvaran 3,0 paketet version (klave Life Sciences).
8. Bioluminescent signaler i en utvald region av intresse kan kvantifieras antingen som den totala flödet (fotoner / s) eller den genomsnittliga radians (fotoner / s / cm ² / SR).

5. Bearbetning av vävnader för att fastställa bakteriehalten och virus titer

1. Möss är avlivas av CO ₂ kvävning och pälsen desinficeras med 70% etanol.
2. Immobilisera djuret på en hård skärbräda.
3. Med en steril skalpell blad, skär genom mitten av huvudet av djuret, från bakre och exponera nasofarynx genom att böja på varje sida av huvudet utåt.
4. Samla nasofaryngealt vävnad av varje djur genom att skrapa den vävnad från varje halva huvudet med hjälp av steril pincett och placera i 1,5 mL iskallt RPMI. Håll på is.
5. Öppna upp bröstkorgen med en sax och ta bort lungorna med hjälp av steril pincett och sax. Skölj lungorna tre gånger i PBS för att avlägsna blod och samla upp i 1,5 mL iskallt RPMI. Håll på is.
6. Använd en homogenisator att homogenisera vävnaderna, placera tillbaka på is.
7. Ta bort en delmängd av det homogeniserade vävnad och använda detta för att bestämma bakteriehalten. Förbered spädningar av vävnaden homogenatet och platta på HBA. Kultur plattorna vid 37 ° C i 18-24 timmar och fastställa livskraftiga räknas. Den bakteriella titrar i ett visst organ kan sedan korreleras med antalet fotoner som observerats i den regionen.
8. Centrifugera resten av det homogeniserade vävnaden vid 3500 rpm i 10 min vid 4 ° C. Samla supernatanten och överföring till rena, sterila rör. Förvara supernatanten vid -70 ° C och bestämma virus titer av plack-analysen.

6. Plack analys för att avgöra influensa A-virus titer i vävnad homogenat

1. Virusinfektivitetsprov titer bestäms av plack på konfluenta monolager av Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler. MDCK celler rutinmässigt odlas i RF10 (tabell 1) i flaskor vävnadsodling (Nunc) och passerats när konfluenta.
2. Lossa MDCK celler från flaskor vävnadskultur med trypsin. Tvätta cellerna i RF10 och samla cellerna genom centrifugering vid 1200 rpm i 5 min. Kassera supernatanten och suspendera pelleterat celler i RF10. Räkna MDCK cellerna med hjälp av en hemocytometer och vitala färgämnet. Seed var 35 mm och av 6-brunnars plattor (Nunc) med 1.2x10 ⁶ MDCK celler i 3 ml RF10 och kultur cellerna vid 37 ° C och 5% CO ₂ för att uppnå confluency (i ~ 24 timmar).
3. Förbered Leibovitz dsL15 media och 1,8% (w / v) agaros overlay medier (tabell 1). Alikvotera dsL15 media och 1,8% (w / v) agaros i 50mL i sterila flaskor. Håll dsL15 medier vid 4 ° C tills den ska användas och agaros vid 56 ° C fram till användning.
4. Kontrollera att MDCK cellen monolager är konfluenta och tvätta cellerna med RPMI + genom aspirera på RF10 och ersätta den med ~ 1,5 ml RPMI +. Inte vid något skede av förfarandet ska plattorna få helt torr ut. Inkubera plattorna vid 37 ° C tills den ska lägga till prover som innehåller viruset.
5. Förbered spädningar av viruset prover i RPMI +. Håll proverna på is tills det ska användas.
6. Aspirera RPMI + från monolager och lägga 135uL RPMI + lämpliga spädningar av virus prov till varje brunn. Varje prov i två exemplar.
7. Inkubera MDCK cellerna med viruset prover för 45 min vid 37 ° C och 5% CO _2. Skaka försiktigt plattorna var 15 minuter att fördela viruset jämnt och förhindra uttorkning av MDCK cellen monolager.
8. Flytta agarosen från 56 ° C till 46 ° C vattenbad och varm dsL15 media till 46 ° C i vattenbad.
9. Efter 45min inkubation av viruset på MDCK monolager, ta tallrikar av 5% CO ₂ inkubator. Ta bort agarosen och L15 media från 46 ° C vattenbad. Tillsätt 0,2 av 0,1% trypsin till 50 ml av dsL15 media, än att lägga 50 ml dsL15 + trypsin till 50 ml 1,8% (w / v) agaros. Blanda agarosen och L15 försiktigt och tillsätt 3 ml av overlay medium till varje brunn på 6-brunnars plattor. Snurra försiktigt för att se hela MDCK cellen monolayer är täckt. När overlay är satt Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO ₂ för 2-4 dagar.
10. I slutet av inkubationstiden, räkna antalet plack som ett mått på virus infectiviTy. Vid behov kan plack kan visualiseras genom färgning av monolager med kristallviolett löst i metanol.

7. Avsnitt C - Secrets till framgång:

1 Alla experimentellt arbete med S. pneumoniae (t.ex. inympning av flytande kulturer, hantering av vävnad från möss infekterade med S. pneumoniae) utförs i ett klass II biosäkerhet skåp.

1,1 Vi skapar självlysande S. pneumoniae stammar genom att införa plasmiden pPJTG28 ^3. Men en mängd olika självlysande S. pneumoniae-stammar finns 4-6. Bioluminescent S. pneumoniae stammar kan också köpas från Caliper Life Sciences Inc (MA, USA).

1,1 Tillväxt kinetik av olika S. pneumoniae stammar kan variera och bör bestämmas för varje stam. Det kan ta mellan 3 till 4 timmar för att nå OD600nm = 0,4-0,45.

1,4 Vi normalt förväntar sig den smittsamma lager för att nå koncentration av 10e8 CFU / ml och rekommendera en utspädning allt från 10e-4 till 10e-8 att bestämma koncentrationen av livskraftiga bakterier.

2.6 lämpligt titer som ska användas för inokulering äggen, beror på vilken virusstam och kan variera från 10e-3 till 10e-5. Influensa A-virus stammar från supernatanter vävnadsodling används ibland snyggt.

3.2a Vi använder rutinmässigt 2000 CFU av S. pneumoniae stam EF3030 att kolonisera 5 dag gammal mus ^3. Den exakta smittsam dos av inokulatet bestäms i efterhand för varje experiment med plätering seriella spädningar av inokulatet på agar hästblod plattor. Förmågan hos S. pneumoniae stam att kolonisera möss är först bestäms av bakterieräkning av vävnad homogenat (t.ex. nasofarynx, lungor) vid flera olika tidpunkter efter inokulering av möss.

3.2b Det är inte nödvändigt att använda anaestetics att administrera bakterier eller virus till djuren via inandning. Spädbarn möss (liksom vuxna möss) bör hållas tillbaka för hand och hålls upprätt av prövaren är inokulatet (3 mikroliter för barn möss, upp till 10 mikroliter för vuxna möss) och sedan tappade på näsborrarna och inandning alla inokulat bekräftas av observationer.

3.2c bort neonatala möss en efter en ur boet och inokulera med bakterier eller virus som behövs. Markera svans av djuret med hjälp av en permanent spritpenna om det behövs och gå tillbaka djuret tillbaka till buren direkt. Gnid djuret med lite strö så att dammen kommer att acceptera valparna tillbaka in i boet. Obs: permanent spritpenna smittar av djuren snabbt och måste appliceras dagligen. Alternativt kan en tatuering-system användas för att identifiera enskilda djur.

3,3 Vi använder 20 PFU influensa A-virus Udorn/307/72 (H3N2) för att smitta från 8 till 14 dagar gamla möss 3. Dödlighet och sjuklighet som observerats i djur beror på stam av S. pneumoniae och influensa A-virus används. Tabell 3 ger en användbar uppsättning av humana slutpunkter och kriterier ingripande för att använda i möss yngre än 21 dagars ålder. Vi brukar inte upptäcker någon mortalitet eller morbiditet när du använder S. pneumoniae EF3030 och influensa A-virus stam Udorn/307/72 (H3N2) när möss är> 10 dagar gamla.

4,2 för att vara korrekt, kan möss vägas före injektion av bedövningsmedel lösningen. Som vägledning är ungefär 50-75 mikroliter av bedövningsmedel lösning som används i 20 dygn gamla möss. Musen är helt bedövad när de inte svarar på en nypa i svansen eller bakbenen. Även i IVIS kommer mössen också utsättas för isofluran som kommer att lägga anestesi. Tidpunkten för avbildning efter infektion i möss beror på stam (er) av S. pneumoniae och influensa A-virus används samt på symtomen av intresse. Utföra några pilotförsök för att optimera tidpunkten för självlysande avbildning kan vara nödvändig.

4,3 Möss kan antingen placeras i en isolerad låda (som hindrar föroreningar från att komma in eller ut ur rutan) eller alternativt kan placeras direkt i instrumentet för avbildning. Vi använder isolering rutan för experiment med spädbarn möss, för att se mössen fortfarande nedsövd under avbildning förfarandet och för att förhindra kontaminering av IVIS med S. pneumoniae och / eller influensa A-virus.

4,3 Använd en ventral bild av möss att få en bild av luftvägarna. En lateral bild av musen ger en mer känslig bild av öronen.

4,4 När möss placeras direkt i kammaren, är isofluran levereras till möss via näsan kottar. För experiment där barn möss används, är isoleringen rutan föredra eftersom näsan konerna inte får plats på barnets möss.

4,5 THan total exponeringstid som behövs för att fånga en bild kan variera mellan olika experiment beroende på styrkan i den självlysande signalen, placering av signalen, bakteriestam och mus stam som använts. Vad gäller det senare, kan både pigment och päls dämpa avsevärt totala detekterbar signal. Kameran på IVIS Spectrum är en back-tunnat, tillbaka upplysta CCD erbjuder ett brett dynamiskt omfång (65536 gråskalenivåer). Helst ska exponeringstiden ställas för att fånga mellan 60 och 60.000 räknas. Enligt vår erfarenhet med C57BL / 6 möss, öka avbildning tid än 7 minuter inte påtagligt förbättrar signal-brus-förhållande. Alternativ för att öka den självlysande signalen är att öka graden av binning (dvs. stora) och med en mindre synfält. Viktigt bör kvantifiering inte utföras på områden inne i bilden som innehåller mättade pixlar, eftersom det ger ett underskattat värde för antalet upptäckta fotoner. Om du är osäker om den optimala förhållanden, kan den automatiska exponeringen Funktionen kan användas som en riktlinje.

4,5 Om en stark självlysande signal i en del av musen är hindrar upptäckt av mareld i en närliggande region, kan utvalda regioner av musen täckas med svart papper och bildbehandling kan fortsätta som vanligt

4,7 Om självlysande signalen kvantifieras i fotoner (i motsats till räknas) variationer i bildbehandling förhållanden (t.ex. bildframställning tid) mellan experiment kommer inte påverka mätningen av självlysande signalen.

4,8 Om du använder det totala flödet för att mäta fotoner i ett specificerat område, se till att samma "region av intresse" formen används för alla prover.

5.1a Möss kan avlivas vid någon tidpunkt efter infektion med influensa A-virus, beroende på intresse av forskaren. Vi bestämmer vanligtvis bakterier och virus titer på 6 dagar efter infektion med influensa A-virus Udorn/307/72 (H3N2) och inte iaktta någon mortalitet / morbiditet. Kommer dock morbiditet och mortalitet observerats i dessa experiment varierar beroende på S.pneumoniae och influensa A-virus stam som används och tidpunkt valde bör ta dödlighet och sjuklighet i beaktande för att minimera påverkan på djurens välbefinnande. Tabell 3 ger en användbar guide till intervention kriterier och humana slutpunkter för användning i dessa experiment. Generellt möss är euthanized och vävnad behandlas som beskrivs inom 3 timmar efter in vivo självlysande avbildning.

5.1b Möss yngre än 10 dagar gamla är resistenta mot hypoxi och avlivades genom halshuggning. I den beskrivna experimentuppställning, möss är minst 14 dagar gammal och kan avlivas genom CO ₂ kvävning.

5,7 Blod-agarplattor kan kompletteras med 5μg/ml gentamicin att förhindra tillväxt av bakteriefloran i homogenat av nasal vävnader. Utbudet av begagnade spädningar beror på S. pneumoniae stam som använts. För experiment i 20 dagar gamla möss med S. pneumoniae stam EF3030 använder vi snygga, 10e-1, 10e-2 och 10e-3.

5,8 Store varje prov av homogeniserade vävnad i minst två portioner, så att en säkerhetskopia prov tillgänglig om viruset plack analysen misslyckas! En korrekt virus titer kan bara erhållas från ett prov tinas en gång efter frysning men inte från proven upprepade gånger frysa upptinade-.

6,1 när den odlas 90-100% konfluenta, kommer ett enda 150cm ² vävnadsodling kolv ger tillräckligt MDCK celler för fem 6-brunnars plattor.

6,5 Den optimala seriella Utspädningseffekten är beroende på vilken virusstam och tiden efter infektion. Normalt skulle vi använder snygg, 10e-1 och 10e-två spädningar för orgel homogenat tagit 6 dagar efter infektion med influensa A-virus.

6,6 Användning av spädningar av virus lager är en lämplig positiv kontroll för användning i varje plack analys. Som negativ kontroll, kan RPMI + användas.

8. Representativa resultat:

Figur 1. Skiss av embryonerade kyckling ägg.

Figur 2. BLI av S. pneumoniae infekterade musen på dag 3 och dag 4 efter håna infektion med influensavirus.

Figur 3. BLI av S. pneumoniae och influensavirus samtidigt infekterade musen på dag 3 och dag 4 efter infektion med influensavirus.

Figur 4. Bakteriehalten i näsan av en singel och en co-infektionTed mus.

Figur 5. Viral titrar i näsa och lunga av en samtidig infektion mus.

Tabell 1. Specifika medier används i detta protokoll.

Tabell 2 Särskilda reagenser och utrustning.:

Tabell 3. Intervention kriterier för spädbarn möss (<21 dagar gammal):

^a När en eller flera "mild till måttlig" tecken observeras öka frekvensen av yttranden till två gånger dagligen och söka råd från djurskyddsansvarige i förekommande fall, så att behandling och vård kan ges.

^b När en eller flera "allvarliga" tecken observeras euthanise möss med hjälp avlämplig metod. Möss <10 dagar gamla är avlivas genom halshuggning, möss> är 10 dagar gamla avlivas av CO ₂ kvävning.

In vivo imaging med IVIS maskinen är en unik metodik som gör att realtid visualisering av mikrobiell patogenes ^{4, 6-9.} Här visar vi tillämpningen av denna teknik för att förstå synergi mellan S. pneumoniae och influensavirus i modersmjölksersättning möss. På grund av den icke-invasiva karaktär denna teknik har vi kunnat följa utvecklingen av infektion i varje enskilt musen över tiden. Detta har vi kunnat dokumentera kinetik pneumokock överföring bland samarbete inrymt spädbarn möss ^3. Den icke-invasiva karaktär denna teknik gör det möjligt för forskare att använda färre djur per försök och därmed minska djurens användning. Det är också möjligt att använda IVIS maskinen för att visualisera spridningen av infektionen till tidigare okända sidor av infektion i kroppen, liksom webbplatser som inte lätt provtagits av dissekering (t.ex. mellanörat).

Innan de imaging experiment, bekräftade vi att kolonisering nivåer i självlysande EF3030 stammen var jämförbara med kolonisering nivåer i moderbolaget EF3030 stammen genom att ange bakterieräkning i vävnaden homogenat. Dessutom bekräftade vi först att infektion med influensavirus resulterat i ökad belastning av självlysande EF3030 till nasofarynx av koloniserade djur som visat med moderbolaget EF3030 stam (resultaten visas ej).

Medan IVIS tekniken är enkel att använda och genererar reproducerbar och lätt att förstå data måste experiment utformas omsorgsfullt så att känsligheten och nytta av tekniken maximeras. Till exempel är känsligheten i IVIS kameran påverkas av djupet och opaciteten av vävnaden ^8, som i vår erfarenhet ökar detektionsgränsen för självlysande signaler som kommer från lungorna. Dessutom minskar mörk päls och pigmenterad hud ljustransmission med så mycket som 10 gånger (jämfört med hårlösa möss) ^8. Under utvecklingen av denna metod har vi optimerat detta protokoll för att användas med 5 till 14 dagar gamla C57BL / 6 möss och har sedan dess visat att IVIS kan användas för att upptäcka koloniseringen av 20 dagar gamla C57BL / 6 möss med självlysande S. pneumoniae EF3030. Dock kan signalen upptäckt öka när dessa experiment utförs på nakna eller BALB / c möss. Ändå representerar IVIS kameran en ny metod för att övervaka, karaktärisera och slutligen förstå in vivo utvecklingen av pneumokocksjukdom efter influensa A-virus infektion.

Produktionen av denna video-artikeln var sponsrad av Caliper Life Sciences.

Författarna vill tacka för de tekniska råd från David Briles (University of Alabama i Birmingham, AL, USA). Vi vill tacka Yvette Chen, djurskyddslagen Officer University of Melbourne, och David Taylor, Animal Facility Manager, för användbara förslag och diskussioner om djurskydd och etik och utveckling av kriterierna för ingripanden och humana slutpunkter för den beskrivna experimenten i detta manuskript.

Odilia Wijburg och Patrick läsning stöds av en NHMRC RD Wright Fellowship, är Kirsty kort stöds av en GSK Forskarutbildning Support bidrag och en Puzey stipendium.

1. Brundage, J.F. & Shanks, G.D. Deaths from bacterial pneumonia during 1918-19 influenza pandemic. Emerg Infect Dis 14, 1193-9 (2008).
2. Petersdorf, R.G., Fusco, J.J., Harter, D.H. & Albrink, W.S. Pulmonary infections complicating Asian influenza. AMA Arch Intern Med 103, 262-72 (1959).
3. Diavatopoulos, D.A., et al. Influenza A virus facilitates Streptococcus pneumoniae transmission and disease. Faseb J (2010).
4. Orihuela, C.J., Gao, G., Francis, K.P., Yu, J. & Tuomanen, E.I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J Infect Dis 190, 1661-9 (2004).
5. Kadurugamuwa, J.L., et al. Noninvasive monitoring of pneumococcal meningitis and evaluation of treatment efficacy in an experimental mouse model. Mol Imaging 4, 137-42 (2005).
6. Smith, M.W., Schmidt, J.E., Rehg, J.E., Orihuela, C.J. & McCullers, J.A. Induction of pro- and anti-inflammatory molecules in a mouse model of pneumococcal pneumonia after influenza. Comp Med 57, 82-9 (2007).
7. Owen, S.J., et al. Nasal-associated lymphoid tissue and olfactory epithelium as portals of entry for Burkholderia pseudomallei in murine melioidosis. J Infect Dis 199, 1761-70 (2009).
8. Luker, G.D. & Leib, D.A. Luciferase real-time bioluminescence imaging for the study of viral pathogenesis. Methods Mol Biol 292, 285-96 (2005).
9. Hutchens, M. & Luker, G.D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol 9, 2315-22 (2007).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.