The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2School of Life Science, Xiamen University
This article is a part of JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 184.73.74.47, User IP: 184.73.74.47, User IP Hex: 3091810863
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).
الاختلاف في الاستجابة للأدوية المضادة للملاريا وتسببها طفيليات الملاريا من بيولوجية والأهمية الطبية. وقد أدى رسم خرائط لتحديد العلاقة ناجحة من الجينات أو الصفات الكامنة مواضع مختلفة في طفيليات الملاريا من القوارض والبشر 1-3 و 4-6. طفيلي الملاريا المنجلية yoelii هي واحدة من العديد من أنواع الملاريا المعزولة من القوارض البرية وأفريقيا وقد تم تكييفها لتنمو في المختبرات. يستنسخ هذا النوع في كثير من الخصائص البيولوجية للطفيليات الملاريا البشرية ، وقد تم أيضا علامات وراثية مثل الصغرية وتضخيم تعدد الأشكال طول جزء علامات (AFLP) وضعت للطفيلي 7-9. وبالتالي ، يمكن إجراء دراسات الجينية في طفيليات الملاريا القوارض لاستكمال البحث في المنجلية. هنا ، علينا أن نظهر للتقنيات لإنتاج عبر الجينية في P. yoelii التى كانت أول من الدكاترة. Walliker ديفيد كارتر ، ريتشارد ، وزملاؤه في جامعة أدنبرة 10.
الجينية الصلبان في P. وتجرى yoelii وغيرها من طفيليات الملاريا التي تصيب الفئران القوارض العضلة المصحف مع اللقاح يحتوي على اثنين من الحيوانات المستنسخة gametocytes متميزة وراثيا التي تختلف في الظواهر من الاهتمام والبعوض عن طريق السماح لتتغذى على الفئران المصابة بعد 4 ايام من العدوى. وأكد وجود المجهر gametocytes الذكور والإناث في الدم الماوس قبل التغذية. في غضون 48 ساعة بعد الرضاعة ، في المعي المتوسط من البعوض ، علما gametocytes فرداني تفرق في الأمشاج الذكور والإناث ، وتسميد ، وتشكيل لاقحة مضاعفا (الشكل 1). أثناء وضع البويضة الملقحة إلى ookinete ، ويبدو أن الانقسام الاختزالي تحدث 11. إذا مشتق اقحة من خلال التلاقح بين الأمشاج من الطفيليات متميزتين وراثيا ، وتبادل الوراثية (الكروموسومات والاندماج تلك المبالغ عبر بين شقا الصبغي غير شقيقة زوج من الكروموزومات المتماثلة ؛ الشكل رقم 2) قد تحدث ، مما أدى إلى إعادة التركيب المادة الوراثية في مواضع مثلي. يخضع كل اقحة شعبتين النووية المتعاقبة ، مما أدى إلى فرداني النوى الأربعة. لمزيد من ookinete يتطور الى البيضة المتكيسة. بمجرد أن تنضج البيوض المتكيسة ، تتشكل من آلاف sporozoites (على سلالة الصليب) وأطلق سراحه في hemoceal البعوض. ويتم حصاد Sporozoites من الغدد اللعابية وحقنها في الفئران استضافة جديدة ، حيث قبل الكريات الحمراء والكريات الحمراء تطوير المرحلة تأخذ مكان. يتم استنساخ أشكال الكريات الحمر وتصنيفها فيما يتعلق الشخصيات المميزة للخطوط الوالدين قبل رسم خرائط الربط الجينية. تتم العدوى من الحيوانات المستنسخة السيطرة الأبوية الفردية في بنفس طريقة إنتاج عبر الجينية.
ويجب تطبيق تقنيات التطهير لجميع المواد التي سوف تدار في الحيوانات لتفادي الاستخدام غير المتعمد للعوامل الخارجية في الفئران المعدية التي يمكن أن نخلط النتائج التجريبية.
1. إصابة فئران المختبر مع طفيليات الملاريا في الدم في مرحلة
2. العدوى المختلطة استنساخ من الفئران
3. تغذية البعوض
4. تشريح البعوض MidgUTS والبيضات العد
5. جمع Sporozoites من البعوض بواسطة الطرد المركزي
6. النسل الاستنساخ باستخدام التخفيف المحدود
7. توصيف النسل باستخدام علامات وراثية
8. الحفظ بالتبريد من طفيليات الملاريا في الدم في مرحلة
9. ممثل النتائج :
في تجربة ناجحة ، وسوف 5-10 ٪ من خطوط المستنسخة تكون ذرية المؤتلف مستقلة.
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لدورة الحياة والأحداث خلال بالتعديل الوراثي عبر الجينية. أحداث بالتعديل الوراثي ستجري خلال المرحلة الأولى من التطوير في البعوض. بعد إخصاب الأمشاج "فرداني" من الذكور والإناث من خلفيات وراثية مختلفة في المعي المتوسط في البعوض ، ويتم تشكيل "مضاعفا" بيضات ملقحة. لاقحة يشكل مرحلة ضعفاني فقط من دورة حياة الطفيل ؛ الانقسام الاختزالي في غضون 12 ساعة بعد الإخصاب ، وجميع مراحل لاحقة في البعوض والثدييات يظل فرداني. وأدى تطوير بيضات ملقحة في ookinetes والبيضات. النمو والانقسام الإنقسامية كل البيضة المتكيسة تنتج الآلاف من sporozoites ، والتي تم إصدارها في hemoceal البعوض. sporozoites تلك التي تهاجر إلى الغدد اللعابية هي في وضع يسمح لها أن تنتقل إلى مضيف الثدييات ، حيث تطور الكبد وخلايا الدم الحمراء مراحل تأخذ مكان. أثناء دورات خلايا الدم الحمراء ، يمكن لبعض الطفيليات تفرق في ناضجة gametocytes الذكور والإناث. اكتمال دورة حياة الطفيل عندما تؤخذ هذه gametocytes بنسبة آخر انتقال البعوض إلى إدامته.
الشكل 2. راثة الجينات النووية في طفيليات الملاريا وإنتاج ذرية المؤتلف. يمكن أن تتولد من خلال بالتعديل الوراثي الاندماج تلك الكروموسومات أو الأحداث كروس. نسل متماثل التي تنتجها إخصاب ذاتي الأمشاج بين الوالدين من استنساخ نفسه 1 أو 2 (A و D) ، على التوالي. B) ذرية متخالف التي تنتجها تلاقح بين الأمشاج من الحيوانات المستنسخة two الأبوية مختلفة ، نوى المؤتلف (الاهليليجات الزرقاء) التي يشكلها الاندماج تلك الكروموسومات وحدها. C) التي تنتج من ذرية متخالف تلاقح بين الأمشاج من الحيوانات المستنسخة two الأصل مختلفة ، نوى المؤتلف (الاهليليجات الحمراء) التي يجري تشكيلها من قبل عمليات الانتقال بين شقا الصبغي غير شقيقة الكروموزومات المتماثلة.
الشكل 3. المورفولوجيا من القوارض yoelii الملاريا المنجلية الطفيلي. أ) المرحلة الطوق ، B) أتروفة ، C) المتقسمة ، D) merozoites ، E) العرسية الذكور غير ناضجة ، F) العرسية الذكور الناضجة ، G) العرسية الإناث غير ناضجة ، H) العرسية الإناث الناضجة ، I) المعى المتوسط مع البيضات في آخر 10 يوما تغذية (البيضات الناضجة المشار إليها بواسطة الأسهم ؛ 200X التكبير) ، J) الغدد اللعابية للبعوض (التكبير 100X) ، K) sporozoites (400X التكبير).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
نبدي تقنيات لإنتاج عبر الجينية في الملاريا المنجلية yoelii القوارض ، وهو ينطبق أيضا على الإنتاج من الصلبان الجينية في malarias القوارض الأخرى. تتم عادة التهابات استنساخ الفئران مع الوالدين واحد لتحديد انتقال ناجحة للطفيليات الوالدين لضمان أن الوالدين هما المختصة في إنتاج الأمشاج وظيفية قبل تنفيذ الصليب.
يتأثر انتقال ناجحة من خلال البعوض عن عوامل متعددة بما في ذلك درجة حرارة insectary ، نوعا من طفيليات الملاريا القوارض المستخدمة ، وجرعة من الدم في مرحلة الطفيلي (قيحة الحجم). بينما حققت عادة انتقال berghei P. 19-21 درجة مئوية في 13 ، ونقل P. تتم بشكل روتيني وyoelii chabaudi P. 23-25 درجة مئوية في 14. Ookinetes من P. berghei لا تتطور إلى البيضات في درجات حرارة أقل من 16 درجة مئوية أو أعلى من 24 درجة مئوية 15. بالإضافة إلى درجة الحرارة ، ويمكن أن تؤثر على حجم قيحة معدل تكاثر طفيليات الملاريا في الدم. على الرغم من حقن اللقاح من حجم كبير (5 × 10 6 iRBC أو أكثر) سيحقق أعلى تطفلن الدم في مراحل مبكرة جدا من المرض ، فإنه لا يؤدي بالضرورة إلى أعداد أكبر من gametocytes العدوى إلى أعلى أو البعوض. وأظهرت Gadsby وآخرون (2009) أن 16 من gametocytes P. chabaudi آدمي موجودة في الدم من يوم 3 إلى يوم 20 (الذروة في اليوم 13) إصابة آخر من 1 × 10 6 iRBC ، ولكن العدوى يوم آخر 6 هو فقط اليوم الذي يصبح البعوض المصابة. أيضا ، وإدارة حجم كبير من سلالات قيحة الطفيليات التي تنمو بسرعة وشراسة مثل استنساخ N67 (nigeriensis) ، 17XL ، وYM من yoelii P. ، أنكا من استنساخ P. berghei ، ونسخة من DS P. chabaudi آدمي غالبا ما يؤدي إلى فقر الدم الحاد وأمراض في الفئران ، والذي يمكن ان يؤدي الى انخفاض كبير في درجة حرارة الجسم الماوس. نتيجة لذلك ، تصبح أقل الفئران المعدية للبعوض (الملاحظات غير منشورة). ومع ذلك ، لم يجر انتقال طفيليات الملاريا القوارض بحجم قيحة القياسي (10 6 iRBC). وقد وجد أن P. berghei وP. yoelii تنتقل إلى البعوض من 3 إلى 5 أيام بعد الإصابة التي يسببها المرحلة الدم في الفئران 17 ، في حين P. chabaudi chabaudi وP. آدمي chabaudi تنتقل فقط على البعوض في يوم 6 بعد مرحلة العدوى التي يسببها الدم في الفئران 16 ، 18.
العوامل التي تؤثر على إنتاج ذرية المؤتلف وتشمل نسب gametocytes من سلالتين الوالدية في الفئران. من الناحية النظرية ، لإنتاج أقصى ذرية المؤتلف يحدث عندما gametocytes من كلا الجنسين من الحيوانات المستنسخة الأبوية في عدد متساو الذاتي والتسميد والتلاقح تحدث في نفس التردد. تحت هذا الشرط ، سيكون من نصف الناتج بيضات ملقحة الهجينة والباقي سوف تتكون من نسب متساوية من سطرين استنساخ الأبوية. وسيتم إنتاج نسل الحيوانات المستنسخة المؤتلف تقلص إلى حد كبير عند نسبة منحازة gametocytes في اتجاه واحد استنساخ الوالدين ، مما يؤدي إلى غير متكافئ الذاتي الإخصاب. علاوة على ذلك ، غالبا ما يكون الطفيليات معدلات النمو المختلفة ، وربما مختلفة في القدرة المنتجة gametocytes 16 و 19. لذا ، فمن الضروري لتحسين نسب الطفيليات الأبوية في الخليط ليتم حقنه في الفئران لتغذية البعوض.
الوقت لاستنساخ الطفيليات من الدم بعد الرضاعة البعوض هو أيضا عامل هام للنظر فيها. فمن الأفضل أن استنساخ سلالة الصليب عند تطفلن الدم الوراثية بين 0،1-1،0 ٪ (قبل دورات كثيرة جدا من النسخ المتماثل في الدم) لتجنب تكرار استنساخ الحيوانات المستنسخة. قد الطفيليات سريعة أو بطيئة النمو الخروج بأعداد كبيرة في فترات معينة من الزمن ، والاستنساخ في قمم الطفيليات سريعة أو بطيئة النمو في نهاية المطاف مع الحيوانات المستنسخة لديها نفس الظواهر.
في الختام ، وأداء الصلبان الوراثية باستخدام طفيليات الملاريا القوارض نسبية سهلة وأرخص بكثير من أداء عرضية الوراثية للطفيلي الملاريا P. الإنسان المنجلية ، وهو ما يتطلب وجود عدوى الرئيسيات غير البشرية. المؤتلف سلالة الصلبان الجينية هي أدوات مفيدة لبناء الخرائط الجينية والربط لرسم خرائط للملاريا الصفات الهامة بما في ذلك تطوير الطفيلي ، ومقاومة العقاقير ، والفوعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
لأن الكتاب والعاملين في الحكومة وهذا هو عمل الحكومة ، والعمل في المجال العام في الولايات المتحدة. بصرف النظر عن أي اتفاقات أخرى ، والمعاهد الوطنية للصحة تحتفظ بحقها في تقديم العمل الذي PubMedCentral للعرض والاستخدام من قبل الجمهور ، وربما PubMedCentral العلامة أو تعديلها بما يتفق مع العمل ممارساتها العرفية. يمكنك وضع حقوق الانسان من خارج الولايات المتحدة في هذا الموضوع الى حكومة ترخيص استخدام.
نشكر الدكاترة راندي الكينز ، Kastenmayer روبن ، توري تيد ، دان وباري ليمان Tovi لقراءة نقدية للمخطوطات. وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث جماعية لشعبة بحوث جماعية ، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعاهد الوطنية للصحة ، والبرنامج الوطني للبحوث الأساسية 973 من الصين ، # 2007CB513103. نشكر NIAID جماعية محرر بريندا راي مارشال للمساعدة.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glyerolyte 57 solution | Cenmed | 4A7833 | |
| Mouse Mus musculus | Charles River Laboratories | Female, inbred, strain Balb/C | |
| Heat-inactivated calf serum | Invitrogen | 26010-066 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution | Invitrogen | 10010-072 | pH 7.4; Cell Culture grade |
| Malaria parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XNL(1.1) | MR4 | MRA-593 | deposited by DJ Carucci |
| Malaria parasite Plasmodium yoelii nigeriensis N67 | MR4 | MRA-427 | deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick |
| Mosquito Anopheles stephensi | MR4 | MRA-128 | deposited by MQ Benedict |
| Cellometer automatic cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer CP2 disposable hemacytometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer CP2 | |
| High Pure PCR template preparation kit | Roche Group | 11 796 828 001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Cell culture tested; insect cell culture tested |
| Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | GS500 | |
| Ketamine hydrochloride | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Cell culture tested; insect cell culture tested |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Cell culture tested; insect cell culture tested |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Xylazine | Akorn Inc | 4811-20ml | Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL |
| Glass wool | VWR international | 32848-003 | |
| Glass capillary (1 L) | VWR international | 53440-001 | |
| Hemocytometer | VWR international | 15170-168 | Complete chamber set |
| Homogenizer | VWR international | KT749520-0090 | Pestle with matching tube, 1.5 mL |
SUPPLEMENTARY MATERIALS:
Maintenance of laboratory mice Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Maintenance of laboratory mosquitoes Mosquitoes are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium yoelii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquitoes are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging. Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously. Measurement of red blood cell density Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density. |
|||
1
ReplyPosted by: Daniel KiboiJuly 10, 2011, 1:39 PM