Протокол по производству Генетические Креста Паразиты грызунов малярией

Асептический методы должны применяться ко всем материалам, которые будут администрируемых в животных, чтобы избежать случайного введения экзогенных инфекционных агентов в организм мышей, которые можно смешивать экспериментальных результатов.

1. Заражение лабораторных мышей с кровью стадии малярийных паразитов

1. При комнатной температуре таяния флаконах, содержащих по два замороженных паразитов этапе крови малярии должны быть скрещены. В этом примере два грызуна штаммы малярийного паразита Plasmodium используются yoelii yoelii и Plasmodium yoelii nigeriensis.
2. Fit шприц с 22-30 колеи (G) иглы и составить 400 мкл стерильной, фармацевтического класса PBS (рН 7,4).
3. Используя тот же шприц, составляет 100 мкл талой инфицированной крови; инвертировать шприцем вверх и вниз, пока содержание однородно смешанные. (Дополнительно: пипетка может быть использована для передачи PBS и инфицированная кровь в пробирку, до перевода в шприц для инъекций).
4. Inject 200 мкл раствора, содержащего паразита непосредственно в брюшной полости мыши. Когда закончите, удалите шприц в мусорном ведре острых предметов. (См. также дополнительные материалы для обеспечения лабораторных мышей). В общем, стандартный размер посевной между 100-500 мкл, в зависимости от уровня паразитных инфекций в оригинальном замороженных материалов.
5. Inject два паразита штаммов для пересекли границу двух мышей в каждой. Мыши станет положительным микроскопически от 3 до 5 дней после инъекции. Когда parasitemias руки между 1-5%, переходите к следующему шагу.

2. Смешанные инфекции клонов мышей

1. До смешанной инфекции клон, собирают кровь из хвоста два донора мышей, зараженных различными штаммами паразита для микроскопического исследования по Гимза окрашенных тонких мазков крови (рис. 3), а также для измерения плотности красных клеток крови (см. дополнительные материалы для детальных процедур) .
2. Рассчитайте объем физиологического раствора (1,5% вес / тринатрия цитрат, 0,85% вес / хлорид натрия) и мышь крови, необходимых для производства посевной смеси с использованием паразитемии и красных кровяных телец измерения плотности, полученной ранее.
3. Отрегулируйте паразита решение конечной концентрации одного миллиона инфицированных эритроцитов в 100 мкл.
4. Комбинат инфицированной крови от двух доноров в соотношении 1:1 для получения смешанного клон посевной. Когда два родительских клонов различаются по скорости роста, регулировать пропорции быстрорастущих родительской к медленно развивающихся родительских клонов до 1:2 или 1:5.
5. Inject 100 мкл смешанного образца в брюшину каждой мыши, чтобы быть инфицированы. (См. также шагом 3,9, чтобы определить количество мышей для инъекций)
6. Используя этот метод, заразить две мыши каждый с одним родительских штаммов. Одно-клон инфекции позволит определение об успешной отправке двух родительских штаммов.

3. Кормление Комары

1. Подготовка три клетки содержащие 300-500 взрослых (мужчины и женщины) Anopheles stephensi комаров каждый, возраст 5-7 дней после выхода из куколки. Контейнеры покрыты сеткой безопасности по пластиковой или металлической крышкой. Два Клетки для кормления по уходу за ребенком клонов, третья клетка для подготовки генетического крест.
2. Начиная через четыре дня после смешанного клон инфекции, подготовить Гимза окрашенных мазках тонкий хвост крови от зараженных мышей.
3. Изучение мазков под микроскопом путем сканирования не менее 50 микроскопических полей на увеличение 1000x и определить, насколько мужчина и женщина гаметоциты присутствуют.
4. Мужские и женские гаметоциты узнаваемы благодаря наличию больших вакуолей и крупные гранулы (рис. 3). Мужские и женские гаметоциты имеют розовый и голубой цитоплазмы, соответственно. Если гаметоциты присутствуют, следуйте шагу 3.6.
5. Если гаметоциты отсутствуют, держать мониторинг в день, пока они появляются. Если гаметоциты присутствуют, продолжить следующий шаг.
6. Inject 50 мкл анестезии препарат коктейлем, содержащим 33 мг / мл кетамина и 3 мг / мл ксилазина в брюшины мыши обезболить каждого инфицированного мыши (за 20 грамм массы тела мыши). Заключительные дозу кетамина и ксилазина это 82,5 и 7,5 мг / кг, соответственно.
7. Место мышей лицом вниз на верхней части клетки содержащие взрослых комаров Anopheles stephensi, которые голодали сахара поставки в течение 24 часов и позволить комаров кормить в течение 30 минут без перерыва.
8. Поддерживать комаров в insectary в стандартных условиях (температура поддерживается между 24-26 ° C, см. также дополнительные методы для обеспечения лаборатории комаров).
9. Используйте один зараженный мыши для каждого 50-100 самок комаров. Усыпить мышей сразу шейки дислокации после кормления в то время как мыши все еще под наркозом.

4. Пройдя Mosquito MidgОТС и подсчет ооцист

1. Через девять дней после кормления, комары будут рассмотрены на ооцист в средней кишки насекомого. Наличие ооцист в комаров, которые питаются одним клоном инфицированных мышей показывает, что гаметоциты из двух родительских штаммов являются инфекционные.
2. Чтобы вскрыть комара кишки, используйте аспиратор подключен к небольшой контейнер для сбора от 5 до 10 инфицированных комаров из клетки.
3. Использование CO ₂ газ, обезболить комаров и передачи их в стеклянной посуде Петри на льду. Отдельный и отбросить мужской комаров. Антенны самцов заметно bushier по сравнению с самками.
4. Заполните два шприца с PBS и вписать их в 26 калибр полдюйма (G ^½) иглы. Депозит около 100 мкл PBS из шприца на предметное стекло.
5. Передача от 5 до 10 наркозом самок комаров на каплю PBS и место скользить по рассекает микроскопом.
6. Используя те же иглы, удалить крылья каждого комара и ноги, затем, держа насекомых в брюшной полости грудной клетки и задней, вытащить тело на части, пока кишки, белый мешок типа тела, не будет отпущена. Отсоедините кишки и отбросить остальные части тела.
7. Добавить еще PBS на средней кишки, если слайды сухие. Средняя кишка будет вырожденной, если позволяют высушить. Место крышка скользить по midguts.
8. Изучить midguts под световым микроскопом при увеличении 100х. Граф количество ооцист в каждой средней кишки (рис. 3). Ооцисты узнаваем как толстостенных кольцевые структуры, которые лежат на внешней поверхности midguts.
9. Когда закончите, распоряжаться шприцы, иглы и слайд бен острых предметов.
10. Если ооцисты отсутствуют в midguts, кормить комаров с зараженных мышей с большим числом гаметоциты и дать больше время кормления. Температура имеет решающее значение для этого шага. Убедитесь, что температура установлена ​​на уровне от 24 до 26 ° C.

5. Сбор Спорозоиты от комаров с помощью центрифугирования

1. Подготовка спорозоита труб коллекцию следующим образом: вырезать крышку чистой 0,5-мл центрифужную пробирку и пробить отверстие (0,1-0,2 мм в диаметре) в нижней части трубки использованием пылали 19 G иглу.
2. Заполните 1 / 3 от трубка со стеклянной ваты. Вставьте фильтр трубки в 1,5-мл пробирки (одна труба достаточно урожая спорозоитов от ~ 100 комаров)
3. На 17-й день после кормления, собирают комаров (Шаг 4) из клетки в небольшом контейнере с помощью аспиратора.
4. Использование CO ₂ газ обезболить комаров.
5. Отдельные женщины из мужской комаров. Передача под наркозом самок комаров из контейнера на стеклянном блюде Петри на льду.
6. Приготовьте два шприца с 26 G ^½ игл заполнены PBS. Депозит около 100 мкл PBS из шприца на предметное стекло.
7. Передача комаров на предметное стекло. Удалить комаров головы, крыльев, ног и живота при вскрытии микроскопом.
8. Использование с острым концом щипцов передачи thoraxes в 0,5 мл PBS в 1,5-мл гомогенизатора (ступку и пестик). Магазин thoraxes на льду (спорозоита остается инфекционным в течение 2-3 ч).
9. Однородный thoraxes на лед, чтобы освободить от спорозоитов слюнных желез (см. Рисунок 3), и передача лизаты (гомогенатах) в трубки, заполненной стекловатой (шаг 5.1-5.2) с использованием стеклянной пипетки.
10. Центрифуга от 10 до 20 сек при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре.
11. Сбор проточные (суспензия очищенного спорозоита), используя шприц с иглой 22-30 G. (Дополнительно: падение 10-50 мкл проточные на микроскопический слайд, место покровное стекло и визуализации живых спорозоитов под стандартный световой микроскоп, 400X увеличение, см. также рис 3)
12. Inject ф 0,1-0,5 мл суспензии в спорозоита мышей (до 200,000 паразиты могут быть собраны из одного комара; см. ссылку 12). В случае успеха, животные будут инфицированы 72 часов после инъекции.

6. Клонирование Потомство использованием ограниченной Разбавление

1. Семьдесят два часа после инъекции спорозоита, собирают кровь из хвоста два донора мышей, зараженных различными штаммами паразита для микроскопического исследования после Гимза окрашивания тонких мазков крови и для измерения плотности красных клеток крови (см. дополнительные материалы для детальных процедур).
2. Выберите мышью отображения 0,1 до 1% паразитемии и чьи инфицированные эритроциты содержат в основном одно паразитов в качестве донора для клонирования. Повторите шаг 6,1 ближайшие дни, если мышей микроскопически отрицательным. Если животные не заражены в течение 14 дней, повторите шаг 2 до 5 и определить наличие спорозоитов в шаге 5.11).
3. Развести собрано хвост крови в холодной 1:01 Решение Решение телячьей сыворотки и млекопитающих Рингера (2,7 мМ хлористого калия, 1,8 мМ хлорида кальция, 154 мМ хлорида натрия), чтобы достичь конконцентрации от 0,6 до 1-инфицированных эритроцитов на 100 мкл, и хранить посевной на льду. Таким образом, большинство индивидуальных мыши должны получить один или нулевой паразитов.
4. Внутривенно вводят по 100 мкл разбавленного инфицированной крови в каждой от 50 до 100 мышей.
5. Через пять-семь дней спустя, экран мышей на наличие паразитов крови стадии рассмотрения Гимза окрашенных тонких мазков крови. В успешный эксперимент, 20-50% мышей заразиться и покажет паразитемии в 0,1-5,0% в 8-й день после заражения.

7. Характеристика Потомство использованием генетических маркеров

1. Соберите 20 до 40 мкл крови мышей хвост в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку, содержащую 0,2 мл охлажденного физиологического солевого раствора цитрата, вихревые кратко, а центрифуги в течение 3 мин при 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре до гранул кровяных клеток. Извлечение ДНК сразу или хранить гранулы при температуре -80 ° C.
2. Подготовка паразита ДНК, используя любые стандартные методы выделения ДНК. Для быстрого изолирования ДНК, использование особо чистых шаблон ПЦР подготовка комплекта (Рош Прикладные Bioscience).
3. Рекомбинантный потомства определены после генотипирования использованием микроспутников (МС) или одиночных нуклеотидных полиморфизма (SNP) на разных хромосомах, которые могут дифференцироваться два родительских штаммов генетическая крест. Упрощенный метод с использованием одного флуоресцентного меченных праймеров для MS генотипирования П. yoelii могут быть использованы (см. 8,9).

8. Криоконсервация крови стадии малярийных паразитов

1. Сбор 0,5-1 мл инфицированной крови пункции сердца с наркозом мышь с паразитемии 5-20% в 5-10 мл охлажденного физиологического раствора.
2. Центрифуга в течение 5 мин при 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Удалите супернатант.
3. По каплям добавить 2x Объем Glycerolyte 57 решения (Fenwal Laboratories) на крови гранул и хорошо перемешать.
4. Передача подвески cryotubes (0,2-0,5 мл на трубку).
5. Магазин криоконсервированных крови при температуре -80 ° С (до 1 месяца) или в жидком азоте.

9. Представитель Результаты:

В успешный эксперимент, 5-10% от клонированных линий будет независимым рекомбинантный потомства.

Рисунок 1. Схематическое изображение жизненного цикла и генетической рекомбинации событий во время генетические крест. Генетическая рекомбинация события происходят на ранней стадии развития в организме комара. После оплодотворения "гаплоидных" мужской и женской гамет различных генетических опытом работы в средней кишке комара ", диплоидные" зиготы формируются. Зигота представляет собой лишь этап диплоидных жизненного цикла паразита; мейоза следует в течение 12 часов оплодотворения, и все последующие этапы комаров и млекопитающие остаются гаплоидными. В результате зиготы развиваются в ookinetes и ооцисты. Рост и митотического деления каждого ооцисты производит тысячи спорозоитов, которые высвобождаются в hemoceal комаров. Те, спорозоиты, что переход на слюнные железы находятся в состоянии быть переданы млекопитающего, где развитие печени и красные клетки крови этапах происходит. В ходе красный циклы клеток крови, некоторые паразиты могут дифференцироваться в зрелые мужские и женские гаметоциты. Цикл паразита жизнь заканчивается, когда эти гаметоциты принимаются к другой комар, увековечивая передачи.

Рисунок 2. Наследование ядерных генов в малярийных паразитов и производстве рекомбинантных потомства. Генетическая рекомбинация может быть собрана хромосомных рекомбинации или кроссовер событий. Гомозиготные потомства производства самоопыления между гамет одного и того же родительского клона 1 или 2 (и D), соответственно. Б) Гетерозиготные потомства производства взаимообогащения гаметы двух различных родительских клонов, рекомбинантный ядер (синий овал) формируется путем хромосомного рекомбинации в одиночку. С) Гетерозиготные потомство производится из взаимообогащения гаметы двух различных клонов родителей, рекомбинантный ядер (красный овал) формируется путем пересечения между не-сестринских хроматид гомологичных хромосом.

Рисунок 3. Морфология грызунов малярийного паразита Plasmodium yoelii. ) Кольцо этапе, В) трофозоит, С) шизонта, D) мерозоиты, Е) незрелые мужчины гаметоцит, F) зрелых мужчин гаметоцит, G) незрелых женщин гаметоцит, H) взрослая самка гаметоцит, I) кишки с ооцист на 10 день после кормления (зрелых ооцист указаны стрелками; 200x увеличение), J) слюнные железы комара (100x увеличение), К) спорозоитов (400x увеличение).

Мы демонстрируем методы для производства генетических крест грызунов малярии Plasmodium yoelii, которое также применимо к производству генетического кресты и в других малярии грызунов. Инфекции мышей с одной родительской клоны, как правило, проводится для определения успешной передачи родительских паразитов, чтобы родители компетентных в производстве функциональных гамет перед выполнением крест.

Успешная передача через комара зависит от нескольких факторов, включая температуру insectary, виды грызунов малярийных паразитов используются, и дозы крови стадии паразита (посевной размера). Хотя передача П. berghei, как правило, достигается при 19-21 ° C ^13, передача П. yoelii и П. chabaudi регулярно проводились при 23-25 ​​° C ^14. Ookinetes П. berghei не развиваться в ооцист при температуре ниже 16 ° С или выше 24 ° C ^15. В дополнение к температуре, размер посевной может влиять на скорость размножения малярийных паразитов в крови. Хотя инъекции больших размеров посевной (5 х 10 ⁶ iRBC или больше) дают более высокие паразитемии на очень ранних стадиях инфекции, это не обязательно приведет к увеличению количества гаметоциты или выше инфекционности для комаров. Гадсби и др. (2009) ¹⁶ показал, что гаметоциты П. chabaudi Адами присутствуют в крови с первого дня от 3 ​​до 20-й день (в часы пик на 13-й день) после заражения 1 х 10 ⁶ iRBC, однако, день 6 после заражения является единственным день, в который комары заражаются. Кроме того, администрация большой размер посевной быстрорастущих и вирулентных штаммов паразитов, таких как клоны N67 (nigeriensis), 17XL, и Ю. М. П. yoelii, клон ANKA П. berghei, а клон DS П. chabaudi Адами часто приводит к тяжелой анемии и патологии у мышей, которая может вызвать значительное падение температуры тела мыши. В результате, мыши стали менее инфекционного для комаров (неопубликованные данные). Тем не менее, передача малярии паразиты грызунов была проведена с стандартного размера посевной (10 ⁶ iRBC). Было установлено, что П. и П. berghei yoelii могут передаваться комарами от нескольких дней от 3 ​​до 5, после крови стадии вызванной инфекции у мышей ^17, в то время как П. chabaudi chabaudi и П. chabaudi Адами только передаваться комарами на 6 день после крови этапе вызванных инфекциями в ^{16 мышей, 18.}

Факторы, влияющие на производство рекомбинантных потомков включают пропорции гаметоцитов двух родительских штаммов на мышах. В теории, максимум продукции рекомбинантных потомков происходит, когда гаметоциты обоего пола родительских клонов находятся в равном количестве и самоопыление и перекрестное опыление происходит на той же частоте. При этом условии, половина из зиготы в результате будут гибриды, а остальная часть будет состоять из равных пропорциях из двух родительских линий клона. Получение рекомбинантных клонов потомства будет значительно снижается, когда доля гаметоциты смещен в сторону одного родительского клона, что приводит к непропорционально самоопыление. Кроме того, паразиты часто имеют различные темпы роста и может иметь различные возможности в производстве гаметоциты ^{16, 19.} В связи с этим необходимо оптимизировать пропорции родительского паразитов в смесь вводят в мышей для комаров кормления.

Времени, чтобы клонировать паразитов из крови комара после кормления, также является важным фактором для рассмотрения. Желательно, чтобы клонировать потомства генетическую креста, когда паразитемии составляет от 0,1-1,0% (до слишком много циклов репликации в крови), чтобы избежать клонирования дублируется клонов. Быстро или медленно растущие паразиты могут выходить в большом количестве в определенные периоды времени, и клонирование в максимумах быстро или медленно растущие паразиты в конечном итоге с клонами одного и того же фенотипы.

В заключение, выполнение генетических кресты использовании паразитов малярии грызунов относительно легко и намного дешевле, чем выполнение генетических крест человека малярийного паразита P. тропической, которая требует заражения приматов. Рекомбинантный потомства генетическую кресты являются полезными инструментами для построения генетических карт связи и для отображения важной малярийного паразита в том числе черты развития лекарственной устойчивости и вирулентности.